中国H3亚型流感病毒生态学与分子进化的研究

病毒生态学与分子进化是一门新兴的学科，研究病毒在各种环境中的关系，可以为今后病毒的研究与防治奠定基础。本研究首次详细对我国14株鸭、鸡等禽流感和马、猪等动物的流感病毒的生态学与分子进化进行了分析研究，初步摸清了这些病毒在我国的流行与进化情况，为今后流感病毒疫苗的应用奠定了理论基础，并为今后的H3或其它亚型流感病毒的研究与防制提供了理论基础。     

獭兔绿脓杆菌病的诊治

獭兔绿脓杆菌病的诊治单虎崔尚金苏振谕王述柏朱杰青姜秀丽王金宝（山东莱阳农学院动物科学系，莱阳２６５２００绿脓杆菌为一种条件性致病菌，但近几年绿脓杆菌病的发生有蔓延之势，在鸡和鸭上表现尤甚，其它动物少见。１９９７年４月，山东某獭兔场６００只４０～５０...     

鸵鸟新城疫研究进展(上)

人类驯化鸵鸟，特别是集约化养殖鸵鸟的历史，较鸡、猪、牛和马属动物等短的多。因此，人类对鸵鸟疾病的认识，远不如其对他家养动物那样久远、深入和全面鸵鸟体型大，价值高，需要较大活动场地，单个鸵鸟场养殖规模有限，这种不同于其他养殖业的特殊情况，给鸵鸟疾病研究工作的开展，带来诸多不便。对鸵鸟新城疫的研究，直到上一世纪80年代末才真正展开。     

单抗—ELISA一步法检测兔粪样中的轮状病毒

用单抗２Ｂ４包被ＥＬＩＳＡ微孔反应板，将处理后的粪样和酶标兔抗ＬａＲＶＩｇＧ同时加入包被孔内孵育，置微型振荡器上振摇，建立了检测粪样中兔轮状病毒抗原的单抗－ＥＬＩＳＡ一步法快速诊断技术，与常规ＥＬＩＳＡ，病毒分离培养，电镜，荧光抗体等作了实验室和临床应用比较，结果证明单抗－ＥＬＩＳＡ－一步法第三特异，快速，简便１，适于基层临床推广应用。     

牛病毒性腹泻病毒链特异性SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用

为了对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)复制过程中正、负链RNA进行定量检测,通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5′端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA。同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对,建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssRT-qPCR)方法,对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测。结果表明,以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(+)RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(-)RT-qPCR]在10~2～10~7拷贝范围内具有良好的线性关系,线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3;敏感性试验结果显示,ssRT-qPCR敏感性较好,ss(+)RT-qPCR最低检测下限为10拷贝,ss(-)RT-qPCR最低检测下限为100拷贝。重复性试验结果显示,所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1%,方法重复性良好。特异性试验显示,所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应,特异性较好。利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析,结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后,BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势。以1 MOI剂量感染MDBK细胞,BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异,整体呈上升趋势。10、1 MOI接毒剂量接种细胞后,BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平,以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平。BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性。该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述,为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段。     

1株犬副流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

试验旨在分离鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对其生物学特性进行研究。用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺脏组织,盲传4代,收集72 h病毒液进行RT-PCR鉴定、电镜观察、血凝试验、热敏性试验、紫外照射试验及病毒一步生长曲线的测定,同时扩增N基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,试验成功从出现咳嗽、流鼻涕等呼吸系统疾病症状的病犬肺脏中分离出1株CPIV,命名为CPIV-BJ01;RT-PCR扩增结果发现,在534 bp处有特异性目的条带。病毒电镜观察发现,其超微结构呈圆形、有囊膜、直径在80～200 nm之间;血凝试验显示,病毒在4和37℃均能凝集1%猪红细胞,与报道的CPIV血凝特性一致;病毒对热敏感,长时间高温下病毒毒价会随之下降;紫外照射可使病毒在短时间内对细胞的感染性急剧下降。病毒一步生长曲线测定结果显示,在12～48 h病毒高速增殖,细胞培养液中病毒滴度急剧上升,之后趋于稳定。CPIV N基因序列与19株有代表性的副流感病毒N基因相比,其核苷酸序列同源性为97.1%～99.8%。遗传进化分析表明,CPIV-BJ01与PIV5 1168-1(登录号:KC237064.1)和PIV5 ZJQ 221(登录号:KX100034.1)位于同一分支上,亲缘关系较近。     

RT-PCR快速诊断禽流感

根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果,设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物,不经病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸, ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出 ３２６ｂｐ的 ＮＰ基因片段。采用该技术对１４个亚型禽流感病毒标准参考株,４个亚型１２株国内分离野毒株,ＲＴ－ＰＣＲ检测的结果都呈阳性;对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒,ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果都呈阴性。禽流感病毒 Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（Ｈ５Ｎ１）和 Ａ／Ａｆｒｉｃａｎ　Ｓｔａｒｌｉｎｇ／Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ１）实验感染鸡样品 ＲＴ－ＰＣＲ检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为３４／４２、３２／４２; ２４／５５、２４／５５, 二者符合率大于９５％。 ＲＴ－ＰＣＲ最少可检测到１０ｐｇ的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行ＲＴ－ＰＣＲ检测,只用６个小时就可得出准确的诊断结果,证明ＲＴ－ＰＣＲ检测方法敏感特异,可用于禽流感的快速诊断。     

干酪乳杆菌胸苷酸合成酶基因的分子克隆与序列测定

本研究的目的是以干酪乳杆菌 Ｌ． ｃａｓｅｉ ３４１０３染色体 ＤＮＡ为模板,利用 ＰＣＲ技术扩增出胸苷酸合成酶（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ,　ｔｈｙＡ）基因,利用玻璃奶回收纯化试剂盒回收纯化ｔｈｙＡ基因,并将其克隆入以红霉素抗性为选择压力的可以在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的质粒ｐＷ４２５ｅ,再转化Ｘ５１感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定、ＰＣＲ扩增鉴定,并对ｔｈｙＡ基因片段进行测序,与已知序列进行同源性比较,结果表明成功克隆了 ｔｈｙＡ基因,全长约 １．１ｋｂ,与国外报道的 ｔｈｙＡ基因同源性达９９％。这为构建以ｔｈｙＡ基因为选择压力的非抗生素抗性穿梭表达载体奠定了基础。