烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶（endo polygalacturonases,endoPGs）是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框（ORF）长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作（接种）之后该基因的表达与未互作（不接种）的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】 烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。     

农用抗生素TS99的分离纯化

TS99是由杀真菌链霉菌产生的一种新型抗真菌农用抗生素。为了明确其适宜的分离纯化工艺,研究了大孔树脂吸附、硅胶柱层析和薄层层析等色谱法分离纯化农抗TS99的条件和效果,结果表明,中等极性的大孔树脂和硅胶是吸附法和色谱法分离纯化TS99的适宜填充剂,其最佳洗脱剂分别为70%甲醇、乙醇∶氨水∶水(8∶1∶1,V/V/V)和展层剂氯仿∶乙醇∶水(2∶3∶1,V/V/V)。发酵液经过预处理后,依次用大孔树脂吸附,硅胶柱吸附层析和薄层层析等分离方法即可获得农用抗生素TS99纯品。     

不吸水链霉菌辽宁变种基因转移系统的建立

以嘧肽霉素生物合成阻断突变株UV2136为研究对象,建立了不吸水链霉菌辽宁变种的基因转移系统.UV2136对硫链丝菌素高度敏感,选择含有该抗生素标记的质粒pU702和pWHM3,探索其转化UV2136的可能性.结果表明:UV2136含有较强的限制修饰系统,采取热衰减法获得原生质体、原生质体热处理、冷处理、EDTA处理、质粒DNA变性等,均不能实现质粒pH702向UV2136的转化.来自非甲基化宿主E.coli ET12567的pWHM3也无法实现转化,而源于E.coli DH5α的甲基化pWHM3.可以低频转化菌株UV2136,转化效率分别为4转化子·μg-1 pWHM3,经自身修饰的pWHM3可实现高效转化,达到104转化子·μg-1pWHM3.     

嘧肽霉素一种新的生物活性组分分离纯化研究

通过生物活性检测发现Streptomyces tz92菌株嘧肽霉素发酵液中一种新的抗细菌生物活性物质,为了明确其适宜的分离纯化工艺,试验研究了利用大孔吸附树脂,硅胶柱层析和分子筛层析分离纯化该组分的条件和效果。试验结果显示,发酵液经过大孔树脂SP825L吸附50%甲醇洗脱、硅胶柱层析氯仿∶正丁醇∶甲醇∶乙酸=42∶2∶4∶2(体积比)洗脱、Sephadex LH-20 70%甲醇洗脱可以得到该组分纯品。     

西南烟区主栽烟草品种叶片发生及生长模拟模型建立

为明确西南烟区烟草叶片发育动态规律,实现烟叶精准可控生产,采用田间对比试验,研究了K326、NC89、云烟85、红花大金元4个主栽品种叶片发生及生长规律,并分别建立Richards生长动态模型。结果表明：所有生长模型R2值均在0.980以上,表明模型准确度很高;4个品种叶片发生模型均是只有缓增期和快增期的非典型“S”型生长曲线,而叶片生长模型均是典型“S”型生长曲线;不同品种叶片数目基本一致,均是38~40片,但叶片发生进程差异明显,红花大金元移栽后35 d达到最大叶片数目,其他三个品种均在移栽后42 d达到最大叶片数目;不同品种中部叶最大叶面积大小顺序为红花大金元＞K326＞云烟85＞NC89,但其生长过程基本一致,缓增期12~14 d,快增期16~17 d,稳增期30~31 d。     

在大白菜上获得烟草花叶病毒

作者于1985—1987在辽南的瓦房店菜地大白菜上获得一个分离物,经常规鉴定证实它是烟草花叶病毒大白菜分离株(TMV_((B_p)))。尔后对其奇主范围、症状及病毒特点等进行了研究,现简报如下。 TMV_((B_p))接种大白菜(福山包头、山东早熟)     

株距对烟苗生长发育的影响

为明确不同株距对烟苗生长发育的影响,以烤烟K326为试验材料,研究了试验托盘根际空间一致(90 cm³)的条件下,不同株距(3、6、9 cm)处理对烤烟苗期根、茎、叶发育和相关生理指标的影响。结果表明,不同株距对烟苗群体结构、新生叶发生速度、叶片数量、各部位叶面积、光合特性、茎高、节距、茎半径、茎木质化程度、根系构型和根系活力均有显著影响,但烟苗株型和伸长量最大的节位不随株距变化而改变。不同株距影响了烟苗群体结构、表型和相关生理指标,根际空间90 cm³、株距6 cm更有助于烟苗的生长发育。     

利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成

重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR扩增,从而获得目的DNA基因片段的方法。该技术在目的基因的人工合成及外源蛋白在宿主中的高效表达等方面显示出良好的应用前景。综述了重叠延伸PCR技术的原理、反应条件的优化及其应用。     

草莓伪温和黄边病毒抗血清制备及血清学检测技术研究

将提纯的草莓伪温和黄边病毒（ＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｐｓｅｕｄｏｍｉｌｄｙｅｌｌｏｗｅｄｇｅｖｉｒｕｓＳＰＭＹＥＶ）作抗原免疫家兔，获得效价较高的抗血清，经ＳＤＳ－对流免疫电泳测其效价为１：１２８．四点疫吸附固定法检测ＳＰＭＹＥＶ效果甚理想，可检测到微量病素，提纯病毒浓度低至０．０５μｇ／ｍｌ仍有效果．酶联免疫吸附测定法检出灵敏度也相当高，当病毒浓度为０．１μｇ／ｍｌ时及病叶汁液稀释至１０２４倍时，仍呈阳性反应．免疫电镜技术检视，ＳＰＭＹＥＶ抗血清能清晰地”捕获”同源病毒，并且有装饰作用，抗血清以稀释为１：５００时“捕获”病毒粒子最多．