辽宁西瓜和甜瓜细菌性果斑病的病原鉴定

辽宁省锦州市凌海市西瓜、甜瓜果实上发生疑似细菌性果斑病,从发病西瓜果实上分离获得了菌株JZ17,从发病甜瓜果实上分离纯化获得了菌株JZX2和JZT8。柯赫氏法则测定表明,接种的西瓜和甜瓜上均表现出与田间病害相同的症状,且从接种的发病植株上又重新分离到相同的菌株。采用西瓜噬酸菌检测试剂盒进行DAS-ELISA鉴定,表明3个菌株均呈阳性反应。设计特异性引物YH1/YH2,对3个菌株的16S-23S rDNA ITS序列进行扩增,3个菌株的ITS序列与西瓜噬酸菌各菌株ITS序列的同源性均高达99%以上。综上可知,菌株JZ17,JZX2和JZT8可鉴定为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)。利用特异性引物PL1/PL2对3个菌株进行亚群鉴定,结果表明菌株JZ17和对照菌株AAC00-1(亚群Ⅱ)均可扩增出大小为332 bp的片段,而菌株JZX2、JZT8和对照菌株pslbtw8(亚群Ⅰ)未扩增出此条带,因此可将菌株JZ17鉴定为西瓜噬酸菌亚群Ⅱ型菌株,菌株JZX2和JZT8鉴定为I型菌株。为比较3个菌株的亲缘关系,采用通用引物27F/1492R对3个菌株的16S rDNA序列进行扩增,获得了目的片段,在GenBank中进行同源性比对的结果表明,菌株JZ17,JZX2,JZT8与A. citrulli各菌株16S rDNA的相似性均达99%以上。利用NeighborJoining法构建的系统发育进化树结果表明,菌株JZ17与江西地区菌株JXZS6处于同一分支,菌株JZX2,JZT8与广东地区菌株XJ-6,pslb-25亲缘关系较近。首次报道辽宁省凌海市发生的西瓜和甜瓜细菌性果斑病,并鉴定其病原菌,为该病害在辽宁省的检疫和防控奠定了基础。     

烟草原生质体制备体系的优化及PVY~N导入研究

植物原生质体是除去细胞壁后仍具有活力的裸露单细胞,其在植物RNA病毒的复制机理研究方面具有广泛的应用。为了获得高产、高活力的烟草原生质体,以烟草(Nicotiana tabacum Linn.)品种K326为材料,对原生质体制备体系中的不同细胞壁酶解液成分、酶解时间、酶解渗透压稳定剂含量、离心时间以及离心转速等因素进行优化。结果表明:在含1%纤维素酶,0.5%离析酶,0.6mol·L-1甘露醇的酶解液中,26℃慢速震荡(40r·min-1)酶解4h,700r·min-1离心3min,得到产量及活力较高的原生质体,可直接用于植物病毒的接种试验;利用聚乙二醇(PEG)融合法向获得的高活力原生质体中接种马铃薯Y病毒N株系(Potato virus Y necrosis strain,PVYN),经培养后提取总RNA,通过PVYN特异性引物经RT-PCR扩增后检测条带明显,表明PVYN成功导入烟草原生质体并自我复制。     

烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶（endo polygalacturonases,endoPGs）是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框（ORF）长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作（接种）之后该基因的表达与未互作（不接种）的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】 烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。     

辣椒轻斑驳病毒凤城分离物的鉴定、全基因测序及系统进化分析

辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒上重要的病原病毒之一,近年来PMMoV对辽宁部分辣椒产区造成严重危害。本文采用DAS-ELISA检测以及RT-PCR的方法首次从辽宁省凤城市蔬菜产区辣椒病叶中检测出PMMoV,暂命名为PMMoV-FC。设计3对特异性引物对其进行扩增并测序后得到该病毒分离物全基因序列。将PMMoV-FC的全基因序列与已报道的国内外9个PMMoV分离物进行同源性分析,结果表明,其同源性介于94.3%~99.7%之间。基于全基因序列的系统发育进化分析表明,PMMoV-FC与国内分离物、日本分离物以及美洲分离物亲缘关系密切,而与韩国和西班牙分离物亲缘关系稍远。鉴于该病毒在辣椒上造成的严重危害,对于PMMoV-FC在辽宁地区的发生以及防治仍需进行更为详细的研究。     

辽宁省蔬菜病毒病调查与鉴定

本研究于2014—2015年,针对辽宁省茄科(番茄、辣椒)、葫芦科(黄瓜)、豆科(菜豆)、十字花科(白菜)几种主要蔬菜,对烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、菜豆萎蔫病毒(BBWV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和芜菁花叶病毒(Tu MV)进行Dot-ELISA检测,对辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)进行RT-PCR检测。调查中共采集样品778份,病毒总检出率为14.4%。其中,TMV、CMV、BBWV、Tu MV、PMMo V均有检出,检出率分别为11.3%、6.5%、1.9%、7.6%和0.6%,CGMMV在各地均未检出。从各地区病毒发生情况来看,凤城地区蔬菜病毒种类较多,发生较重。此次调查中有12份样品被检测出有复合侵染的现象,占总检出率的1.5%。