胶体金试纸条检测H9亚型禽流感病毒的研究

对禽流感病毒H9亚型血凝素单克隆抗体4C4进行胶体金标记,喷涂于玻璃纤维上制成金标垫,鸡抗AIVIgG和羊抗鼠IgG分别包被于硝酸纤维素（NC）膜上作为检测线和质控线,制作禽流感H9亚型免疫层析检测试纸条。验证结果表明,试纸条操作简单,肉眼于10min内可判定结果,对H9亚型禽流感病毒及其标准血凝抗原具有高度特异性,与其它亚型禽流感病毒标准抗原及其它禽类病毒没有交叉反应,检测灵敏度比HA试验高4倍以上。试纸条在室温保存6个月、4℃保存12个月,其特异性及灵敏度没有明显变化。对实验室送检及临床采集的共311份喉头拭子进行检测,结果与本室研制的禽流感ELISA试剂盒总符合率为92％,随机选取10份阳性样品经病毒分离证实无一误检。结果证明,本研究建立的H9亚型禽流感病毒免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合用于H9亚型禽流感病毒的现场检测及鉴别诊断。     

检测4种有机磷农药胶体金免疫层析试纸条的研制

本文通过制备有机磷农药半抗原,研制出一种能够检测蔬菜、水果中有机磷农药的胶体金免疫层析试纸条,辛硫磷、对硫磷、丙溴磷、氯唑磷等有机磷农药的检测限均为200μg/kg,检测时间仅为15min,假阳性率和假阴性率均为0,符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求,试纸条能够应用到基层实验室的大批量样本检测,具有实际意义。     

胶体金试纸条半定量检测鸡蛋中磺胺嘧啶残留

采用竞争反应模式建立了鸡蛋中磺胺嘧啶(SD)残留的胶体金试纸条半定量检测方法。该试纸条由吸样材料、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、吸水材料组成。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,胶体金标记SD单克隆抗体;SD竞争物包被于硝酸纤维素膜,制成胶体金试纸条。该试纸条在15min内可完成对SD残留的半定量检测,读条系统判定灵敏度为5μg/L,肉眼判定检测限为10μg/L,与其他磺胺类药物无交叉反应,在鸡蛋中的回收率为71%~96.7%;用试纸条与ELISA对来自动物试验的52份鸡蛋样品进行对比检测,以10、100ng/g为cutoff值,两者阳性(大于100ng/g)符合率为100%,弱阳性(10~100ng/g)符合率为72.7%,阴性(小于10ng/g)符合率为84.2%,两者总符合率为94.2%。该方法灵敏度高,简便快速,无需特殊仪器设备,有良好的开发应用前景。     

链霉素胶体金快速检测试纸条的研制

本研究建立了一种基于免疫胶体金技术的链霉素快速检测方法。该方法检测灵敏度10ng·ml-(101ppb),蜂蜜样本检出限是40ng·ml-(40ppb),单个样本检测时间为5～10min。所研制试纸条产品检测变异系数小,批1间、批内检测结果重复性良好,可以应用于蜂蜜样本中链霉素的快速检测和现场筛查,具有较高的市场应用前景。     

鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的 H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0-8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释）,将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10³、1:10³、1:10⁵、1:10³。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6 % 。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测。     

PCR－核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分

[目的]提高动物源性成分检测效率,建立PCR-核酸试纸条快速检测技术体系。[方法]针对物种特异性DNA序列,设计并标记引物;建立并优化PCR反应体系;利用通用核酸试纸条进行结果判读。[结果]试验表明,PCR-核酸试纸条特异性高;绝对灵敏度为0.001 3 ng/μL,混合样品,实际灵敏度为0.01%;加工处理样品,实际灵敏度为0.1%;最低检测限检出率为100%,稳定性良好。[结论]综上,PCR-核酸试纸条方法是一种既有PCR反应的高灵敏度,又具有免疫学检测的特异性好的特点,同时操作简便的快速检测方法。     

番茄斑萎病毒4种检测方法比较

本研究根据番茄斑萎病毒(TSWV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因保守序列设计特异性引物,比较了4种检测方法的灵敏度。结果表明,特异性引物可扩增出397bp的片段,序列和已发表的TSWV核苷酸序列同源性高达99%,可用于常规PCR和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测。qRT-PCR的灵敏度比快速检测试纸条、双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和常规PCR分别高出15 625倍、3 125倍和125倍,且能够准确定量;常规PCR灵敏度较高,但不能准确定量;DAS-ELISA方法适用于批量定性测定,但检测时间较长;试纸条法检测速度最快,但灵敏度最低,使用时可根据症状程度和试验条件选择适宜的检测方法。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒磁免疫层析试纸条的研制

用磁性纳米颗粒标记黄瓜绿斑驳花叶病毒的兔多克隆抗体建立了简便快速的磁免疫层析试纸条检测方法。该方法检测提纯病毒的灵敏度为0.1 μg/mL,检测葫芦病汁液可稀释10 000倍(重量／体积)。试纸条和黄瓜绿斑驳花叶病毒具有特异性反应,和同属的烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒和齿兰环斑病毒,未出现交叉反应。该试纸条可用于田间病害检测和诊断。     

免疫层析快速诊断试纸条的制备及在动物疫病诊断上的应用

胶体金标记免疫层析技术作为一种新型的免疫学快速诊断和检测技术,具有微量、特异、简便等特点,非常适合基层使用。作者综述了免疫层析快速诊断试纸条的基本原理、制备方法及目前在动物疫病诊断上的应用情况。     

口蹄疫诊断技术研究进展

口蹄疫是世界上危害最严重的动物疾病之一,可使世界范围内的畜牧业遭受严重的经济损失,并危害人体健康。而防制口蹄疫的重要环节是要作出及时、准确的诊断。本文对口蹄疫新型诊断技术包括基因芯片技术、免疫层析快速诊断试纸条、实时荧光定量PCR技术、生物传感器的研究进展进行了介绍。