十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物，建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法，并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示，此方法最适反应温度为64.4℃，优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应；与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应；具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内，结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点，为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择，有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

健康和患病克氏原螯虾肠道微生物群落结构和多样性分析

为探索健康克氏原螯虾(Procambarus clarkii)与患病克氏原螯虾在肠道微生物菌群结构和多样性方面的差异,采集健康虾(对照组)和患病虾(患病组)样品,通过Illumina高通量测序技术测定样品虾的肠道微生物组成,并利用Simpson指数评估样品中微生物的多样性。结果显示:所有样品共检出400个种水平上的OTUs(operational taxonomic units),归属于25个门(phylum);对照组肠道微生物的优势菌为厚壁菌门(Firmicutes),而患病组的优势菌为变形菌门(Proteobacteria)。进一步分析表明,患病组变形菌门的占比显著高于对照组,Simpson指数提示,患病组的生物多样性较对照组显著下降(P<0.05)。结果表明,患病克氏原螯虾肠道微生物中变形菌门的占比显著上升,生物多样性显著下降(P<0.05)。     

日照地区养殖凡纳滨对虾肝肠胞虫病的检测及分析

为进一步掌握虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)病的暴发流行情况,对日照地区养殖的凡纳滨对虾开展了检测及调查工作。EHP孢壁蛋白基因PCR(SWP-PCR)检测结果显示,阳性产物的序列与NCBI数据库中EHP的孢壁蛋白基因序列有高度的相似性,EHP的阳性检出率在10%左右。对虾养殖池水样检测结果显示,发病池与未发病池中各水质参数变化趋势基本一致。     

虾夷扇贝闭壳肌蛋白溶解性与三磷酸腺苷的关联性

刚采捕的活品虾夷扇贝立即进行4℃冷却干藏,分别于0、48、72、96、120 h采5只样本,分离出横纹肌与平滑肌,测定其三磷酸腺苷及其关联化合物含量,同时测定贮藏0、48、120 h扇贝肌肉的蛋白溶解性,以探究肌肉蛋白溶解性与扇贝活品品质的关系。试验结果表明,冷却干藏期间扇贝活力呈下降趋势,三磷酸腺苷在贮藏120 h后几乎消耗殆尽,而蛋白溶解性在高离子浓度范围内有明显上升趋势,120 h后表现出最好的溶解性。此外,三磷酸腺苷酶活性受到乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)抑制时肌肉匀浆表现较好的溶解性,碎肉经漂洗处理会导致肌肉三磷酸腺苷含量下降,肌原纤维蛋白溶解性升高。最后,对比肌肉均质前后三磷酸腺苷含量,发现均质处理导致肌肉三磷酸腺苷全部降解。虾夷扇贝闭壳肌蛋白质的溶出机制受三磷酸腺苷影响,对于捕后早期活力状态较好的扇贝,其三磷酸腺苷含量与蛋白溶解性的关联需要进一步系统探索。     

红螯螯虾累代繁养群体的遗传多样性分析

为研究国内不同繁养基地红螯螯虾群体的遗传结构特征,采用线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列直接测序的方法,获取红螯螯虾国内6个繁养群体(安徽阜阳、浙江湖州、广东珠海、江苏镇江、海南澄迈、江苏苏州)共180个样本的COⅠ序列。试验结果显示,序列比对长度为831 bp,其中变异位点56个,简约信息位点16个。基因序列G+C(%)含量较低(39.765%),表现出较明显的碱基组成偏倚性。180个样本共检测到10种单倍型,其中单倍型H1出现次数最多,为安徽阜阳、广东珠海、江苏镇江、海南澄迈、江苏苏州群体的共享单倍型。国内红螯螯虾繁养群体的遗传多样性较高,所有样本的总体单倍型多样性指数为0.693,核苷酸多样性指数为0.00652。其中苏州群体的单倍型多样性指数最高(0.964),海南澄迈群体最低(0.618)。不同群体间的遗传距离为0.00403～0.00969,海南澄迈和安徽阜阳群体间的遗传距离较大(0.00969),广东珠海和江苏苏州群体间遗传距离最小(0.00403)。试验结果表明,国内红螯螯虾繁养群体保持着较高的遗传多样性,群体间存在着一定的基因交流。试验结果为后续合理开发利用国内红螯螯虾种质资源积累了数据资料。     

光唇裂腹鱼幼鱼指环虫和斜管虫病并发症及两种治疗方法的效果比较

水温13～20℃下,将体长为3～5cm、鳃丝检出活体指环虫和斜管虫的光唇裂腹鱼Schizothorax lissolabiatus幼鱼放入装有10L水的充气水桶中,采用CuSO_4和FeSO_4·7H_2O合剂(5∶2,简称CuFe合剂)和精致敌百虫粉杀灭,比较联合用药及先后用药两种方法的治疗效果。联合用药系指精致敌百虫的浓度分别为2g/m~3、3g/m~3、4g/m~3、5g/m~3和6g/m~3,然后加入0.7g/m~3CuFe合剂;先后用药系指剂量同下,但先使用敌百虫杀灭指环虫,再使用CuFe合剂杀灭斜管虫。设5个试验组和1个对照组。结果表明,联合用药物对两种寄生虫的杀灭作用显著,但是对鱼体的伤害较大;先后用药时,效果不如联合用药明显,但是对鱼体的伤害较小。若鱼体同时感染指环虫和斜管虫时,需酌情用药;若鱼体感染严重,建议联合用药;在感染初期,建议以上两种药物先后使用。     

蛹虫草高效栽培技术

野生冬虫夏草面临灭绝,但因营养保健价值较高,市场消费需求走高。因此,为满足消费者的需求,采取人工培植蛹虫草,以代替野生冬虫夏草。介绍了人工培养蛹虫草的方法,包括培养基配制、接种、管理采收及包装等。     

自毒物质对羟基苯甲酸降解细菌ZH2的分离与应用

自毒物质是造成植物连作障碍的主要因子,研究旨在筛选能够降解土壤中自毒物质的细菌。采用选择性分离方法从土壤中筛选自毒物质对羟基苯甲酸降解菌;结合形态特征、生理生化特征和16S rRNA测序鉴定菌种;采用紫外分光光度法测定菌株降解对羟基苯甲酸能力,并通过盆栽实验验证解毒效果。结果表明,分离到1株有降解对羟基苯甲酸能力的菌株,编号ZH2,经鉴定为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。在纯培养条件下,当对羟基苯甲酸浓度为5 mg/mL时,ZH2能在培养72 h时将其降解97%。盆栽条件下,当基质中对羟基苯甲酸浓度为10 mg/g时,ZH2能有效缓解对羟基苯甲酸对黄瓜的生长抑制作用。该研究从土壤中分离到能够降解对羟基苯甲酸的绿针假单胞菌,具有应用于连作障碍防控的潜在价值。