常见景天高温胁迫细胞伤害率试验

以7种常见景天科多肉叶片为材料进行温度梯度处理,用电导率法测定细胞伤害率,观察供试材料对高温胁迫的耐受性。结果表明,55℃是姬秋丽、薄雪万年草、黄丽、胧月、八宝景天的细胞伤害率跃升临界温度,60℃是佛甲草和垂盆草的跃升临界温度。供试景天种类的叶型大小和取样方式不影响试验结果。     

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。     

马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响

旨在研究马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）烯醇化酶（enolase，Eno）对小鼠肺泡巨噬细胞（RAW264.7）吞噬能力的影响。通过构建原核表达质粒获得重组烯醇化酶（rEno），采用台盼蓝活细胞计数法，判定在不同处理浓度和时间下rEno蛋白对RAW264.7细胞的细胞毒性。将rEno蛋白与RAW264.7细胞共孵育后，用SEZ作用于细胞并检测细胞吞菌数量，判断RAW264.7细胞对SEZ的吞噬活性。进一步通过活细胞稳定同位素标记技术（SILAC）和蛋白质谱分析技术（LC-MS/MS），筛选到RAW264.7细胞中可能与SEZ Eno存在相互作用的候选蛋白。结果发现，10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理对RAW264.7细胞有明显的细胞毒性，且10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理RAW264.7细胞2和4 h可显著抑制其对SEZ的吞噬作用（P<0.01、P<0.05）。初步筛选到RAW264.7细胞中动力蛋白激活蛋白亚单位蛋白（dynactin subunit protein 2，Dctn）、整合素α-M蛋白（integrin alpha-M）等17种可能与Eno发生互作的蛋白。本研究获得了rEno重组表达蛋白，发现rEno可减少RAW264.7细胞对SEZ的吞噬，互作蛋白的初步筛选也为进一步揭示Eno在SEZ抗吞噬中的作用机制奠定了基础。     

猪lncRNA TCONS_00791383对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为了探究lncRNA TCONS_00791383对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织（心、脾、肺、肾、背肌和腿肌）以及猪骨骼肌卫星细胞增殖分化前后TCONS_00791383的表达水平；通过设计反义核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）片段在猪骨骼肌卫星细胞中对TCONS_00791383进行敲低，检测敲低TCONS_00791383之后增殖分化标志基因的表达量变化；通过trans （co-expression）对TCONS_00791383进行靶基因预测，使用DAVID对其进行GO富集和KEGG通路分析。结果显示，TCONS_00791383在猪心脏中表达量最高，在脾和肾组织中不表达。在骨骼肌卫星细胞从增殖到分化的过程中，TCONS_00791383的表达量逐渐上升，且在分化后30 h表达量达到最高。在使用ASO片段敲低TCONS_00791383之后，与对照组相比，在分化24 h，增殖标志基因Pax3、Pax7表达量显著或极显著降低（P<0.05，P<0.01），分化标志基因MyoG表达量极显著降低（P<0.01），在分化48 h，增殖标志基因Pax3表达量极显著降低（P<0.01），Pax7表达量显著降低（P<0.05），分化标志基因MyHC表达量显著降低（P<0.05）。预测得到的相关靶基因富集到AMPK、ATP等多个与骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程相关的重要信号通路。本研究表明，lncRNA TCONS_00791383可能促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。     

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞（PK15）的转染效率，为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象，用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况，采用CCK-8检测细胞存活率，进而比较3种方法的转染效果。结果显示，转染PK15细胞后，电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体（P<0.01），但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著（P>0.05）；EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好，脂质体方法较差，与细胞转染效率基本一致；CCK-8结果显示，电穿孔转染后细胞存活率最低，极显著低于对照组（P<0.01），脂质体方法显著低于对照组（P<0.05），慢病毒方法与对照组间差异不显著（P>0.05）。综合考虑转染效率及细胞活性，本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞，为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

矿物种类对微生物利用木质素形成细胞代谢产物及矿物-菌体残留物的特性影响

微生物驱动下的木质素降解与腐殖质形成关系密切,然而在真实土壤环境中腐殖化进程无法摆脱矿物的参与,为探索矿物对于木质素参与腐殖化进程的影响机制,文章采用液体摇瓶培养法,通过向添加高岭石、蒙脱石、针铁矿、δ-MnO_2或三羟铝石的木质素培养液中接种复合菌剂,试图在110 d培养期间动态考察其细胞代谢产物的总有机碳(TOC)含量、光密度值(E4/E6)以及矿物-菌体残留物的回收率,进而明确5种土壤常见矿物对于微生物利用木质素所得产物的特性影响。结果表明:(1)培养10 d后,针铁矿、δ-MnO_2和三羟铝石对于矿物-菌体残留物回收率的促进作用要大于高岭石和蒙脱石,110 d培养结束后,针铁矿对于矿物-菌体残留物回收率的提升效果最大,而蒙脱石影响下的回收率最小。与未添加矿物的条件(CK1)相比,δ-MnO_2、三羟铝石、高岭石和蒙脱石的参与均有利于持续稳定培养期间沉淀物质的回收率;(2)在整个培养期间,高岭石参与下细胞代谢产物的TOC含量均为最大,而δ-MnO_2参与下的TOC含量皆为最小;(3)在5种矿物的添加条件下,微生物利用木质素所形成的细胞代谢产物,其有机碳分子结构先有所复杂而后再趋于简单,尽管如此,在培养结束后,其分子复杂程度均高于CK1处理,与各自培养10 d的结果相比,高岭石、蒙脱石和三羟铝石均有利于细胞代谢产物中有机碳分子结构的复杂化,而针铁矿和δ-MnO_2却使其结构更加简单。     

MTS法检测番鸭呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞活力的影响

采用MTS法检测接种不同致病力番鸭呼肠孤病毒12h、24h、36h、48h、72h、96h后对番鸭鸭胚成纤维细胞(MDEF)活力的影响。根据细胞病变情况和活力状态确定细胞发生变化的拐点,初步探讨番鸭呼肠孤病毒感染诱导细胞凋亡的发生和细胞活力的特征变化,进一步了解番鸭呼肠孤病毒与宿主之间的相互关系,为研究番鸭呼肠孤病毒感染和致病机理提供时间科学依据。结果表明,接毒后36h,细胞活力达到最高,高致病力YB毒株作用于MDEF,细胞活力在48h大幅下降并出现明显细胞凋亡;低致病力YJL毒株作用于MDEF,则在72h可出现明显细胞凋亡。     

牛源ATG13的克隆表达及功能分析

细胞自噬是细胞的一种自我保护机制。本研究选取牛源autophagy related gene 13(ATG13)为研究对象,通过分子生物学方法,对ATG13蛋白进行了鉴定与分析。原核表达及Westenblot鉴定发现,ATG13基因编码的蛋白大小为53k D左右。研究结果为研究牛源ATG13蛋白的生理功能及调控机制积累了前期实验数据,同时为生物医学与生物材料学领域中进一步开发利用牛源ATG13蛋白奠定了基础。     

不同炮制方法对人参皂苷含量及肝癌细胞凋亡的影响

为了探讨不同炮制方法对人参皂苷含量及肝癌细胞凋亡的影响,采用HPLC法测定人参液中单体皂苷Rg1、Re、Rb1(三者合为总皂苷)和稀有皂苷Rg3的含量;MTT法检测不同人参提取液对人肝癌细胞HepG2的抑制率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果表明,在人参炮制过程中,人参总皂苷含量由0.56%下降到0.13%,稀有皂苷Rg3含量由0.17%增加到0.30%;抑制率检测结果表明,浓度为28.8 g/L时3种提取液对细胞的抑制作用最强,黑参组对肝癌细胞的抑制作用高于人参组和红参组;凋亡实验发现,黑参提取液对细胞的促进凋亡作用明显,人参提取液的促凋亡作用不明显。表明红参和黑参提取液可以抑制人肝癌细胞HepG2增殖并促进其凋亡,可能与参液中的稀有皂苷Rg3含量有关。     

瑞香狼毒化学成分抑制PC-12细胞神经突起生长活性研究

对瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)的化学成分进行研究,采用硅胶色谱、凝胶色谱、高效液相色谱等多种色谱手段对瑞香狼毒的乙酸乙酯提取物进行分离纯化,利用NMR、MS波谱分析鉴定3个木质素、1个二萜原酸酯、3个双黄酮、2个黄酮。枇杷素(5)、异落叶松树脂醇(7)和(-)-落叶松树脂醇(8)为首次从该植物中分离得到。PC-12细胞活性试验表明,双黄酮类化合物(狼毒色原酮(2),新狼毒素B(3),异新狼毒素A(4))对NGF依赖的PC-12细胞突起生长有较强的抑制活性(P0.05)。