牛Mx1基因重组慢病毒载体的构建及沉默Mx1细胞的获得

采用RT-PCR技术从牛肾细胞中扩增出Mx1基因,构建牛Mx1基因过表达重组载体;针对牛Mx1mRNA序列设计shRNA引物对,构建针对牛Mx1的RNAi载体。将牛Mx1的过表达载体和RNAi载体共转染293T细胞,利用Western blot方法检测牛Mx1蛋白的表达情况,筛选有效沉默牛Mx1的shRNA;将有效沉默Mx1的RNAi载体转染牛胎儿气管原代上皮细胞,经流式细胞分选,Western blot检测,获得沉默牛Mx1的稳定细胞系。结果表明,成功构建了牛Mx1过表达重组载体pcDNA3.1-Mx1和RNAi载体RNAi-Mx1A、RNAi-Mx1B、RNAi-Mx1C,筛选到RNAi-Mx1A沉默牛Mx1效果最好;经流式细胞分选和Western blot检测,获得有效沉默牛Mx1的牛胎儿气管原代上皮细胞,为进一步探讨牛Mx1抗病毒作用及机制的研究奠定试验基础。     

酿酒酵母细胞壁和细胞膜应对高渗胁迫机制研究

酿酒酵母是食品发酵最常用的菌种之一,酵母应对高渗胁迫的能力决定食品发酵的成功与否以及食品腐败的危害程度。为研究高糖压力对酿酒酵母的影响,测定了酿酒酵母在应对极端高糖压力(0. 6 g/m L)时细胞壁几丁质和葡聚糖含量的变化,采用CFW染料和葡聚糖特异性降解酶对细胞壁的敏感性进行分析,并进一步通过双染料(PI和Hoechst 33342)染色对酿酒酵母细胞膜完整性进行分析,最后通过RNA测序研究了酿酒酵母在极端高糖压力下表达的全局差异基因。结果表明:高糖压力改变了酿酒酵母细胞壁和细胞膜的特性。全局转录测试结果显示,高糖压力通过下调酿酒酵母与细胞壁完整性(CWI)信号传导途径相关的基因ROM1、RLM1、PIR3、YGP1、CWP1等,进行细胞壁损伤的应激反应,高糖压力还通过下调酿酒酵母与细胞膜成分相关的基因(如PDR15和YOR1)造成了细胞膜损伤。最后,比较了酿酒酵母在不同压力因子(0. 2 g/m L糖、0. 4 g/m L糖、0. 6 g/m L糖和柠檬醛压力)下细胞依赖RLM1调控的CWI信号传导途径的差异调节,结果发现,在CWI中起关键作用的RLM1仅在0. 6 g/m L糖的极端压力下被下调。     

鹅掌式深松联合整地机

黑龙江省建三江分局创业农场，2003年10月购进22台鹅掌式深松联合整地机，该机用于秋后深松整地，配合起垄中耕机，可起1．4m(两垄间距)的大垄，为大垄密植直接播种打下良好的基础。     

甘蓝型油菜依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段克隆及hpRNAi载体构建

依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的关键酶。本研究首先构建带有种子特异性napin启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-nap及带有组成型35S启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-35S;然后用PCR法从甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)中油119总基因组中扩增出依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段,再以扩增出的PFK基因片段作模板设计引物扩增出一个相应的小片段。将两个PFK基因片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰(RNAi)提高含油量的基因工程研究奠定了基础。     

紫杉烷14β-羟基化酶基因片段的克隆及其植物表达载体的构建

采用CTAB法提取中国红豆杉基因组DNA,利用PCR技术克隆得到紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)基因前半段,测序结果表明DNA片段序列为915bp,与报道的14OH基因同源性为98.3%。然后将获得的DNA片段(915bp)正反向插入到二元载体pZh01的GUS两端,构建成14OHRNAi植物表达载体pZ14a,又选其中与羟基化酶家族其他成员同源性低的部分(390bp),正反向插入到二元载体pZh01的GUS两端,构建成14OHRNAi植物表达载体pZ14b。同时将克隆得到的DNA片段(915bp)反向插入到二元载体pZh01中,构建成14OH反义RNA植物表达载体pZ14c。经PCR和酶切图谱分析鉴定,确认载体构建成功。     

葡萄果实cDNA文库的构建及鉴定

构建葡萄果实cDNA文库是研究果实发育相关基因表达调控的基础工作.本实验从巨峰葡萄果实中提取了高质量的RNA,利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成cDNA第一链,用特异引物进行LD-PCR扩增合成双链cDNA.将分级纯化的带有粘性末端双链cDNA与λTrip Ⅰ Ex2载体连接,重组载体体外包埋成为cDNA原始文库.初步鉴定原始文库的滴度为1.32×106 pfu/mL,文库扩增后滴度达1.45×1010 pfu/mL.从扩增文库中随机挑取250个克隆进行PCR鉴定,结果表明重组率为98.7%,插入片段大小在0.5～2.0 kb之间,因此,本研究成功构建了葡萄果实cDNA文库.     

植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。     

胁迫相关蛋白激酶基因OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应

水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶Sn RK2,又称胁迫相关蛋白激酶(stress-activated protein kinase genes in rice,Os SAPKs),在调控水稻非生物胁迫信号传导中起着重要作用。本研究对Os SAPK2的结构及其在水稻抗白叶枯病反应中的功能进行了初步研究。结果表明Os SAPK2被定位于细胞核和细胞质内,与Os SAPK1、Os SAPK3同属于Kulik’s II组。Os SAPK2-RNAi转基因水稻中Os SAPK2下调表达,人工接种水稻白叶枯病菌后,转基因水稻比受体对照的病斑长度显著增长,抗病相关基因Os LRR1、Os HIR1表达水平下降,感病相关基因Os MAPK5表达水平升高。此外,Os SAPK2具有自激活活性,可能与Os MAPK5等胁迫相关蛋白互作。上述结果为进一步研究Os SAPK2调控水稻抗白叶枯病的分子机制提供了信息。     

青椒整枝技术的研究—环状剥皮对生育和产量的影响

本文以“土佐狮子尖椒”品种为试材,对环状剥皮的作用进行探讨.经环状剥皮处理后,早期产量比对照增加29.4～52.6%;果实的干物质占有率也比对照有所增加,而根系的发育情况和直径大于1毫米的粗根数目均低于对照.叶面积指数、净光合率及相对生长率在进行环状剥皮后也低于对照.     

不同微生态制剂对蛋鸡机体超氧化物歧化酶调节机制的影响北大核心CSCD

本试验旨在研究不同微生态制剂对蛋鸡机体超氧化物歧化酶(SOD)调节机制的影响。选择360只健康的海兰褐蛋鸡,随机分成5组,每组3个重复,每个重复24只。对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮,试验组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组)分别在基础饲粮中添加0.5%中药乳酸菌、0.25%乳酸菌制剂+0.25%中药红曲霉制剂、0.5%乳酸菌制剂和0.5%中药红曲霉制剂。试验期为79 d。结果表明:1)与对照组相比,试验组中蛋鸡血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著提高(P<0.05),Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组蛋黄中T-SOD活性显著提高(P<0.05)。2)与对照组相比,Ⅱ组蛋鸡肝脏中SOD1 m RNA的表达量显著提高(P<0.05),Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ组的蛋鸡肝脏中SOD2 m RNA表达量显著提高(P<0.05)。由此可见,饲粮中添加上述微生态制剂能调节蛋鸡机体SOD机制,以添加0.5%中药乳酸菌制剂效果最好。