转Pi9抗稻瘟病基因水稻株系的比较转录组分析

【目的】在转录水平上解析Pi9基因介导的稻瘟病抗性调控机理,为培育抗病水稻品种提供理论依据。【方法】向水稻品种日本晴(NPB)及其转Pi9抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)接种稻瘟菌。分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h提取叶组织样品,选取12503个水稻基因定制基因芯片,进行水稻基因转录组分析,并通过qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。【结果】NPB/Pi9在接种后12 h、24 h和36 h的基因表达量分别与其接种0 h表达量比较,共检测到7754个差异表达基因;相应地,感病水稻NPB在以上时间点共检测到7385个差异表达基因;在接种后36 h,NPB/Pi9的差异表达基因数目显著多于NPB。比较NPB/Pi9和NPB相同时间点的基因表达量,共获得4065个差异表达基因,其中接种后36 h的差异表达基因显著多于接种后0 h、12 h或24 h。因此,NPB/Pi9的稻瘟病防御反应更强烈。对NPB/Pi9与NPB相同时间点的差异表达基因进行GO和KEGG分析,细胞外区域、植物对刺激应答、转录调控、氧化还原、离子结合、次生代谢和植物激素相关的GO分类在接种后呈显著富集,苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成和植物激素信号途径的KEGG通路在接种后显著富集。与效应分子触发的免疫反应(ETI)相关的水杨酸信号途径、几丁质酶,以及与病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)相关的胞外区域、对刺激的应答、木质素合成等,均在抗感水稻之间差异表达。而且PTI/ETI共有的WRKY转录因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信号途径等发生差异表达。综上所述,NPB/Pi9和NPB的差异表达模式与ETI和PTI相关,两者相互联系并在Pi9介导的稻瘟病抗性中发挥作用。【结论】与日本晴比较,抗病基因型NPB/Pi9对稻瘟病防御反应更强烈。转录因子、激酶、NBS-LRR基因、几丁质酶、水杨酸、茉莉酸和乙烯信号途径,以及植物次生代谢在Pi9介导的稻瘟病抗病反应中发挥重要作用。     

江苏近年育成粳稻新品种/系的稻瘟病抗性基因及穗颈瘟抗性分析

【目的】明确水稻品种携带的抗稻瘟病基育种应用价值,是利用抗病基因培育抗病品种控制病害流行的重要前期工作。【方法】利用功能标记分析了14个抗稻瘟病基因在江苏近年育成的195个粳稻新品种/系中的分布情况,并对其中158个品种和17份携带抗稻瘟病基因Pigm的高世代回交株系进行穗颈瘟接种鉴定。【结果】大多数品种携带2~5个抗病基因,但所有品种均不含有Pigm基因;Pib、Pita和Pikh基因在供试品种中的分布频率较高,均在45%以上,其余基因均在30%以内;Pid3、Pid2、Pia、Pb1在新育成品种中的出现频率明显高于审定品种。测试品种对穗颈瘟的抗性主要与3个基因显著相关,贡献率由高至低依次为Pia、Pi3/5/i和Pita;其中,Pia或Pi3/5/i与Pita间的聚合效应均显著高于各基因单独存在时的抗病效应,且以Pia和Pita间的聚合效应最强,携带该基因组合的所有品种对穗颈瘟均表现抗至高抗水平抗性。回交导入Pigm基因的所有17份株系对穗颈瘟的抗性均显著高于各自轮回亲本,且均达到了抗病以上水平。【结论】抗病基因Pigm及基因组合“Pia+Pita”在江苏粳稻抗穗颈瘟育种中具有重要的育种应用价值。     

水稻蜡质稀少突变体wax1的鉴定及基因定位

【目的】 蜡质是植物表面的一种重要保护物质,筛选和鉴定水稻蜡质相关突变体有助于解析水稻蜡质形成的遗传机制。【方法】利用EMS诱变籼稻品种湘早籼6号,从突变体库中筛选出一个蜡质稀少的突变体wax1,考查突变体的形态特征和农艺性状,利用突变体与02428杂交的F₂群体定位目标基因,并通过荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】与野生型相比,wax1突变体具有叶片短小皱褶、叶表面蜡质晶体减少、穗长变短等形态特征;在农艺性状方面,突变体的株高、每穗总粒数和千粒重显著降低,但有效穗数显著高于野生型;遗传分析表明,wax1的突变表型受一对隐性核基因控制,将WAX1基因定位在第10染色体上SSR标记RM5806与InDel标记P1之间,物理距离约为49.8 kb;定位区间内的测序结果表明,突变体中β-酮脂酰-CoA合酶的编码基因发生单碱基突变,导致催化活性中心的一个氨基酸发生改变。WAX1基因的突变显著提高了同源异型盒基因OSH6的表达,同时引起部分IAA基因的差异表达。【结论】WAX1基因突变引起叶表面蜡质晶体的减少,同时通过影响茎尖分生组织和生长素的信号转导引起植株生长发育等多方面的异常。     

金刚砂辅助农杆菌进行玉米基因转化研究

对超声波处理方式进行改进,在超声波处理时,加入金刚砂以辅助EPSPS基因转导到玉米幼胚中。结果表明,800粒处理种子播种出苗93株,玉米苗经大田glyphosate筛选有27株具有抗性,进行PCR电泳检测,显示23株阳性,初步证明EPSPS基因已经转化到玉米植株中,转化率为29%。金刚砂辅助处理玉米基因转化具有可行性,利于生产实际操作。     

科尔沁奶牛防御素基因BNBD5原核表达产物的生物活性研究

目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。     

不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】 筛选不同温度下烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染后枯斑三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】 N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline,PBS）,48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90（N. tabacum var. TN90）基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）,并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】 4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 737条已知lncRNA、40 169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】 不同温度（25℃和31℃）条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。     

重组GSTA3蛋白对福美双诱导的肉鸡TD中抗凋亡基因BAG-3表达的影响

【目的】肉鸡胫骨软骨发育不良（TD）是肉鸡常见的一种骨骼性疾病,研究重组GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡软骨细胞中抗凋亡基因BAG-3表达的影响,为治疗TD提供新的思路和方法。【方法】将120羽1周龄肉雏鸡随机分为6组（编号为A、B、C、D、E、F组）。A、B、C组为基础日粮对照组,D、E、F组为添加福美双日粮诱导TD组。试验饲喂福美双2 d诱发TD,在添加福美双第1、3、5、7天,腿部肌肉注射重组鸡GSTA3蛋白和磷酸盐缓冲液,A组与D组注射（100 μg·kg ^-1）磷酸盐缓冲液;B组与E组注射低剂量（100 μg·kg ^-1）GSTA3;C组与F组注射高剂量（200 μg·kg ^-1）GSTA3。试验历时23 d。添加福美双后1、2、4、6、10和15 d采集胫骨生长板。通过Real-time qPCR检测BAG-3基因的mRNA水平,利用免疫组化来检测BAG-3蛋白表达水平。【结果】Real-time qPCR结果显示,TD损伤修复期内,相比较于基础日粮对照组,福美双对照组肉鸡胫骨生长板中BAG-3 mRNA的表达水平基本都显著上调（P<0.05）;相比较于福美双对照组,E和F组在第2、4、10、15天都有显著差异,且在第10和15天显著低于福美双对照组（P<0.05）,表明与D组相比恢复较快。免疫组化结果表明BAG-3蛋白在肉鸡胫骨软骨细胞的增殖区和前肥大区无表达,只在肥大区细胞质中表达;福美双组与空白对照组相比,BAG-3蛋白表达增加;福美双高低剂量组与未注射蛋白的福美双组相比,重组GSTA3增加了肥大区的蛋白表达水平（第10和15天）。【结论】在福美双诱导肉鸡发生TD的过程中,GSTA3重组蛋白能够通过调控BAG-3表达参与凋亡途径,抑制细胞凋亡。在TD损伤修复期,注射GSTA3后使抗凋亡基因BAG-3蛋白表达增强,从而可参与细胞凋亡来缓解TD损伤,使得肉鸡TD生长板功能较快地恢复正常。     

2018〜2019年我国部分地区新城疫病毒的F基因序列分析

本研究自2018-2019年从疑似感染新城疫的家禽病料分离鉴定出13株新城疫病毒(Newcastle disease viruses,NDV),采用RT-PCR方法对这13株NDV分离株的F基因进行扩增,产物经TA克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株进行遗传进化分析。结果显示,其中的7株属于基因Ⅱ型,5株属于基因VI型,1株属于ClassⅠ亚型。F基因相似性分析结果显示,7株基因Ⅱ型毒株与疫苗株La Sota.Bl sClone 30的核昔酸相似性在9&1%-100%之间,氨基酸的相似性在97.6%~100%之间。5株基因VI型分离株与Ⅱ、Ⅶ型疫苗株及VIb亚型代表株之间的核昔酸相似性在79.7%-98.4%之间,氨基酸的相似性在76.6%-97.6%之间。1株基因Ⅰ型的分离株与Ⅱ,Ⅶ型疫苗株及Class Ⅰ代表毒株的核昔酸相似性在52.1%-97.3%之间,氨基酸的相似性在68.5%-96.8%之间,表明当前部分地区的NDV分离株与传统疫苗株之间存在较明显的遗传特征差异。     

黏虫CYP9A113基因的克隆及外源物质对基因表达的诱导效应

黏虫是我国作物上最重要的害虫之一。细胞色素P450能够参与昆虫外源物质代谢。本研究采用RACE技术克隆了一条编码黏虫P450基因的cDNA序列,并通过Real-time PCR技术,检测了4种外源物质对该基因表达的诱导效应。该基因被国际P450命名委员会命名为CYP9A113,GenBank登录号为KY436739。利用2.5%高效氯氟氰菊酯乳油的LD_(50)处理黏虫3 h,LD_(10)、LD_(30)和LD_(50)处理12 h和24 h,可诱导表达CYP9A113基因;20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂的LD_(10)处理黏虫12、24和48 h,LD_(30)和LD_(50)处理24 h,CYP9A113基因表达呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL香豆素处理6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇处理3、6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应。