草菇ras启动子区域的克隆及其序列分析

根据Kajiwara S等报道的ras启动子的序列设计并合成一对特异引物，以草菇菌丝的总DNA为模板，通过PCR扩增，获得一条长约0．75kb片段。DNA序列测定结果表明，该片段长度为751bp。采用Blast软件和Promoter predictions软件进行启动子序列结构分析，结果表明，该片段中243-293bp和539-589bp两区域为ras启动子的基础启动子区。在283bp和579bp处有两个转录起始位点，在244～247bp和292～295bp之间有2个TATAbox，在36～39bp、377～380bp、434-437bp和716～719bp之间有4个CAATbox。此外，该片段中还含有9个Gbox、12个Ibox、2个Pbox以及3个重要顺式作用元件：ABRE元件、WUN-motif(基元)和HSE元件。     

pCAAFP66表达载体的构建及其大豆遗传转化的研究

以pCAMBIA3301为载体骨架,afp为目的基因,构建了大小为9868 bp的大豆表达载体pCAAFP66,该载体带有抗冷冻蛋白基因afp和筛选标记基因bar.以大豆品种华春3号和华春6号的胚尖和子叶节为外植体,应用农杆菌介导法进行遗传转化,以草甘膦(PPT)为筛选底物.结果表明:在胚尖转化体系中,华春3号和华春6...     

小白菜RING锌指蛋白基因的克隆及其表达分析

锌指蛋白在调控植物防御和抗性方面具有重要作用。根据从小白菜中获得的与铜胁迫相关的RING锌指蛋白基因TDF片段设计引物,应用RACE技术克隆出具有完整阅读框的小白菜RING锌指蛋白基因,该基因全长855 bp,开放阅读框606 bp,编码202个氨基酸,分子量为21.32 ku,理论等电点为6.87,属于中性蛋白。结构分析结果表明,该蛋白C-端含有1个保守的C3HC4型RING锌指结构域。进化树分析结果显示,小白菜RING锌指蛋白与芜菁RING锌指蛋白的相似度高达98%,属于C3HC4型RING锌指亚家族。RT-PCR分析结果表明,在铜胁迫下该基因下调表达,推测其可能参与对铜胁迫的应答反应。此结果为进一步研究该基因在小白菜逆境应答中的作用机制奠定基础。     

食用菌DNA提取方法研究

采用不同的方法，对白灵菇（Pleurotua nebrodensis）和赤芝（Ganoderma lueidum）的总DNA进行提取，通过对不同方法所提取到的总DNA经琼脂糖凝胶电泳和酶切鉴定分析，结果表明：不同菌种的最佳提取方法不同，白灵菇最佳提取方法是CTAB改良法，赤芝的最佳提取方法是FDEB法。     

香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定

以香菇基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆了香菇1个ras启动子Lras,2个gpd启动子Lgpd1和Lgpd2.这3个启动子的大小分别为715bp、1056bp和611bp,与已报道的ras和gpd启动子的同源性很强.对这3个启动子的分析结果表明,它们都含有丰富的启动子顺式作用元件.将这些启动子片段分别与GUS基因连接构建了表达载体,并将这些表达载体导入草菇菌丝体中,检测其活性,最终显示3个片段都有启动GUS基因表达的能力,其中Lgpd1启动子活性最强,Lras启动子次之,Lgpd2最弱.     

铜胁迫下小白菜叶片基因表达谱的cDNA-AFLP分析

本研究以小白菜品种‘上海青’为试验材料,利用Cu2+质量浓度为10 mg·L-1的营养液水培小白菜幼苗,通过cDNA-AFLP技术分析小白菜响应铜胁迫相关基因及其表达情况。试验中利用多态性较好的135对引物进行扩增,共获得5 800多条转录衍生片段(TDFs),平均每个引物组合扩增出30~60条,片段大小主要集中在100~1 000 bp,根据条带强弱和有无的变化,其表达模式可以分为持续表达、瞬时表达、上调表达和下调表达4种情况。通过筛选获得180条差异表达TDFs,其中上调表达77条(42.8%),下调表达61条(33.9%),瞬时表达42条(23.3%)。选取其中152条差异表达TDFs进行回收测序,最终得到151个有效序列,其中上调表达68条(45%),下调表达50条(33.1%),瞬时表达33条(21.9%)。Blastx比对结果显示,112条TDFs序列与已知基因具有较高的相似度,涉及能量代谢、物质合成与运输、逆境响应、信号转导等多种途径,16条TDFs序列与功能未知或假定基因的同源性较高,其余23条TDFs序列与已知功能基因的同源性较低或零匹配,可能是一些新的铜胁迫应答基因。从151条TDFs选取4条TDFs,以小白菜actin基因为内参照,对其在不同胁迫处理时间的表达情况进行荧光定量RT-PCR验证,分析结果与cDNA-AFLP结果基本吻合,表明cDNA-AFLP技术是研究小白菜铜胁迫相关基因差异表达的有效方法。小白菜铜胁迫相关基因表达情况较为复杂,涉及多种代谢途径。本研究结果可为探讨小白菜铜胁迫的分子机理和相关基因的克隆提供理论依据。     

分子模拟对接和定点突变提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶的活力

【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰Co A的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大肠埃希菌重组表达,突变重组酶特性经体外酶促反应测定。【结果】3种突变重组酶的相对分子质量为67 000;最适反应温度均为32.5℃,与野生酶DBAT一致;DBAT~(F160C)与DBAT的最适反应pH为7.5,略高于DBAT~(C165W)和DBAT~(N300I)的最适反应pH(7.0);DBAT~(C165W)、DBAT~(F160C)和DBAT~(N300I)的比活力与DBAT相比分别提高了61.5%、59.6%和19.2%,催化效率分别提高了55.4%、35.1%和2.9%,3种突变酶的米式常数(K_m)和最大反应速率(v_(max))均高于DBAT。【结论】疏水突变导致突变酶的比活力相比野生型均有显著提高,研究结果为体外高效酶促合成紫杉醇化学半合成的直接前体物巴卡亭Ⅲ奠定了基础。