Flag-ALD融合载体构建及蛋白表达

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是感染鱼类的最常见致病菌之一，为了解维氏气单胞菌中丙氨酸脱氢酶（alanine dehydrogenase，ALD，EC 1.4.1.1）的调控功能，笔者通过分子克隆获得 Flag-ALD 融合表达载体，并在大肠杆菌中大量表达该蛋白。即以维氏气单胞菌C4基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增获得N端带有Flag标签的ald基因，将带有标签的目的基因与原核表达载体pACYCDuet连接，并将重组质粒pACYCDuet-Flag-ald 转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中。添加异丙基?β?D?1?硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导重组蛋白大量表达。SDS-PAGE分离与Western blot结果表明，来源于维氏气单胞菌的Flag-ALD重组蛋白在E.coli中以可溶性形式成功表达。本实验构建的Flag标记靶标蛋白可为研究丙氨酸脱氢酶在维氏气单胞菌中的功能以及在生物抑菌剂方面的应用提供技术支持。     

辣椒抗坏血酸生物合成酶GME基因家族的鉴定和表达分析

GDP-甘露糖-3′,5′-异构酶基因(GME)是抗坏血酸途径中的关键限速酶,该基因可以调节AsA合成。为了解辣椒中GME基因家族功能及在非生物胁迫下的表达情况,通过生物信息学方法对辣椒GME基因家族进行鉴定,并对基因结构、结构域、系统进化关系、基因表达模式和非生物胁迫表达情况进行分析。结果表明,在辣椒中有2个GME家族成员,CaGME1和CaGME2,分别分布在3号和8号染色体上,都有6个外显子;CaGME1和CaGME2蛋白均具有NADB Rossmann家族中高度保守的NADPH结合位点、底物特异性结合位点,均不具有信号肽,为亲水性蛋白,定位在细胞质粒的可能性最高,均不具有跨膜结构,二级结构主要以不规则卷曲和α-螺旋为主;系统进化树分析表明,该基因编码的氨基酸序列与番茄和马铃薯的亲缘关系最近;qRT-PCR分析结果表明,在低温、茉莉酸甲酯和盐胁迫下CaGME1和CaGME2均被诱导上调,在赤霉素下均被诱导下调。综上可知,CaGME1和CaGME2基因在胁迫下不同的表达情况表明其在非生物胁迫中发挥作用,可为辣椒逆境胁迫机制研究提供参考。     

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。     

玉米XYLPs基因家族表达模式及其蛋白结构分析

通过生物信息学的方法对玉米木质形成素类阿拉伯半乳糖蛋白(xylogen-like arabinogalactan proteins,XYLPs)基因家族的表达模式和蛋白结构进行了分析。ZmXYLPs基因家族成员在染色体上的分布具有一定的偏好性。基因复制事件不仅在基因家族成员数量的扩张和进化中发挥重要作用,同时还可能引起基因表达部位的扩张。根据ZmXYLPs蛋白结构特点,可将其分为两大类。其中仅ZmXYLP10/13/14蛋白存在N连接的糖修饰位点,其余ZmXYLPs蛋白均为O连接糖修饰位点。结果显示,玉米ZmXYLPs的生物学功能可能与其糖基侧链有关,并且其作用并不局限于维管组织发生过程,可能也参与生殖发育过程。     

秀珍菇原基形成相关基因PpFBD1的克隆与表达研究

前期研究中通过对秀珍菇经低温诱导后不同发育阶段样本进行转录组测序及差异表达基因分析发现,ID为Cluster-6377.64510的基因(命名为PpFBD1)在原基形成前期的样本中高表达。为进一步了解分析其表达特性及功能,根据转录组测序结果设计特异性引物,利用RT-PCR技术从秀珍菇中克隆获得了该基因的cDNA全长。该基因由342个核苷酸组成,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白,蛋白相对分子质量约11 ku。进化树分析显示,PpFBD1编码蛋白与糙皮侧耳hydrophobin1编码的疏水蛋白亲缘关系最近。Gene Ontology功能分析表明,PpFBD1主要参与真菌类细胞壁的合成。荧光定量RT-PCR检测显示,该基因在菌丝体经低温诱导后恢复至室温阶段(原基形成前期)表达量最高,这表明其可能参与调控秀珍菇原基形成过程。本研究结果为阐明秀珍菇原基形成机制提供参考。     

PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞的表达及其与卵泡液孕激素含量的关系研究

为研究丝氨酸蛋白酶23(PRSS23)在蛋鸡卵泡中的表达部位及其mRNA在颗粒细胞中的表达与孕激素(P_4)分泌的关系,选取直径为3～5 mm的大白卵泡(LWF)和直径为6～8 mm的小黄卵泡(SYF),应用免疫组织化学技术对PRSS23进行组织定位;分别选取小白卵泡(SWF)、LWF、SYF、大黄卵泡(LYF),用1 mL注射器抽取卵泡液,测定不同大小等级前卵泡卵泡液中P_4的含量;刮取位于卵泡内膜上的颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测PRSS23基因mRNA在蛋鸡不同大小等级前卵泡颗粒细胞中的表达情况。结果显示,PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞层、膜细胞层和卵丘细胞均有表达,在SYF颗粒细胞层表达量最高;PRSS23基因mRNA在SYF中的含量显著高于其他卵泡(P0.05);P_4在SYF卵泡液中的含量显著高于其他卵泡卵泡液(P0.05)。以上结果表明,PRSS23在SYF中可能会通过促进颗粒细胞分泌P_4来影响卵泡的选择。     

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）基因，并进行生物信息学分析，探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列（登录号：XM_001927795.6）设计引物，PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列，使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构，并进行同源性比对及系统进化树构建，利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示，猪GRP78基因CDS区长1 965 bp，可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明，GRP78理论分子质量为72.3 ku，等电点（pI）为5.06，半衰期为30 h，其水溶液在280 nm处的消光系数为30 495，肽链N端为蛋氨酸（Met），不稳定系数为32.39，属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40，总平均疏水指数为-0.496，无跨膜结构，存在信号肽序列，说明该蛋白属于分泌型蛋白；GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域：HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示，GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示，猪GRP78基因与人（登录号：NM_005347.4）、小鼠（登录号：NM_001163434.1）、大鼠（登录号：NM_013083.2）、山羊（登录号：XM_005687138.3）、牛（登录号：NM_001075148.1）核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%，氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%，各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示，GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达，在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。