外源褪黑素对猪卵母细胞体外成熟及多精受精的影响

本研究旨在探讨褪黑素对猪卵母细胞体外成熟及多精受精的影响。在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加1 nmol/L褪黑素或1 nmol/L褪黑素+1 nmol/L Luzindole作为试验组,不添加褪黑素及Luzindole作为对照组,检测卵母细胞核成熟率、多精受精率,并观察体外受精胚胎的发育能力及与多精受精相关的细胞器分布情况。结果表明：各组间卵母细胞核成熟率及体外受精胚胎的卵裂率无显著差异;褪黑素组的猪卵母细胞多精受精发生率较其他2组降低（P<0.05）,囊胚形成率提高（P<0.05）,同时猪卵母细胞皮质颗粒及高尔基体的正常分布情况得到显著改善。结果证明,在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加1 nmol/L褪黑素可显著改善卵母细胞成熟质量,抑制多精受精的发生。     

2-氨基乙基联苯基硼酸酯对绵羊卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响

内质网是蛋白质合成、折叠、修饰的场所,同时作为钙储库,内质网调控钙的储存和释放,维持钙稳态平衡,对支持卵母细胞成熟和早期胚胎发育至关重要。本研究以绵羊卵丘-卵母细胞复合体（COCs）为研究对象,在COCs体外成熟（IVM）培养基中添加不同浓度的内质网钙通道抑制剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯（0、1、10、100、1000μmol/L 2-APB）,探究其对绵羊卵母细胞体外成熟质量和早期胚胎发育效果的影响。结果表明：添加10μmol/L 2-APB组卵母细胞体外成熟率和囊胚发育率均高于对照组和其他试验组（P<0.05）,卵裂率高于对照组（P<0.05）;而随着2-APB(>10μmol/L）浓度增加,卵裂率和囊胚率呈剂量依赖性降低。与对照组相比,IVM培养基中添加10μmol/L 2-APB后胞内谷胱甘肽含量提高（P<0.05）,胞内活性氧水平降低（P<0.05）。综上,在卵母细胞体外成熟培养过程中添加10μmol/L 2-APB对提高卵母细胞体外成熟率、改善卵母细胞体外成熟质量以及提高早期胚胎发育效果具有积极作用。     

卵泡大小和颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

用切割法采集卵泡液,收集卵丘一卵母细胞复合体（Cumulus oocytes comlexs,COCs）和自然裸卵,将部分COCs去除卵丘细胞获得机械裸卵,COCs放入体外成熟培养液中培养为成熟卵母细胞,加入获能的精子液,进行体外受精。结果表明：卵母细胞的体外成熟率和卵裂率与卵泡直径密切相关,大卵泡（80．95％,P〈0．01）和中等卵泡（75．50％,P〈0．05）的卵母细胞成熟率高于小卵泡（50．27％）;犬卯泡（53．53％）和中等卵泡（47．13％）的卵裂率显著高于小卵泡的32．26％（P〈0．05）。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为75．0％、54．2％和10．5％,差异极显著（P〈0．01）,卵裂率分别为53．8％、10．8％和0％,差异极显著（P〈0．01）。对照组和1×10^5、1×10^6个／mL颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为68．6％、69．6％和67．8％,无显著差异（P〉0．05）,但均显著高于1×10^7个／mL（51．5％,P〈0．05）和1×10^10个／mL（35．5％,P〈0．05）颗粒细胞组,但各组间的体外受精率无显著差异（P〉0．05）。结果提示,大卵泡和中卵泡的卵母细胞的体外成熟率和卵裂率显著高于小卵泡,体外成熟培养液中添加高浓度的颗粒细胞能显著抑制卵母细胞的体外成熟。     

3种来源猪胚胎激活后6h内基因组DNA甲基化变化模式

主要探讨猪手工克隆(HMC)胚胎和体外受精(IVF)胚胎及孤雌激活(PA)早期胚胎发育过程中6 h内的单细胞核全基因组DNA甲基化模式.运用抗5-甲基胞嘧啶抗体免疫荧光和激光共聚焦显微镜检测相对荧先强度的方法,检测猪手工克隆胚在融合后6 h内全基因组DNA甲基化模式,并与同时期猪体外受精胚及孤雌激活胚胎进行比较,从而探讨这3种胚胎变化模式的异同.结果显示:3种不同来源的胚胎在培养后不同时间点比较时,2、4、6 h均呈强甲基化状态,且均呈下降趋势;在同时间点比较时,2 h和6 h这两个时间点检测到3种胚胎的相对荧光强度均差异不显著(P＞0.05),而在4 h时,HMC胚胎显著高于PA和IVF胚(P＜0.05).结论:猪手工克隆胚在融合后6h内虽然也发生类似IVF胚的全基因组DNA去甲基化,但其去甲基化不充分,甲基化程度偏高,这可能是导致核移植胚胎核重编程不充分、发育能力低的一个原因.     

兔卵母细胞孤雌激活方法的研究

对兔卵母细胞的孤雌激活方法进行探讨,为兔的体细胞核移植奠定良好的技术平台。体外成熟培养20～22h的兔卵母细胞随机分组,分别进行以下试验：采用不同脉冲电压、脉冲次数和脉冲时间,电激活兔卵母细胞,摸索最佳电激活参数;比较不同的激活方法处理免卵母细胞的效果,Ⅰ：Ion5min＋6-DMAP3h,Ⅱ：Ion5min＋CHX3h,Ⅲ：Ion5min＋6-DMAP联合CHX3h,Ⅳ：电激1次联合6-DMAP＋CHX3h;优化6-DMAP与CHX作用时间。结果显示：当电激参数为：电压40V／mm,脉冲时间20μs和脉冲次数3次时,兔孤雌胚的分裂率和囊胚率最高,可达80．64％和14．51％;采用第Ⅳ种方法激活兔的卵母细胞,胚胎的分裂率和囊胚率（80．64％,13．71％）均显著高于Ⅰ组（66．67％,8．6％）和Ⅱ组（43．21％,1．24%,P〈0．05）,略高于第Ⅲ组（77．59％,12．07％）;当兔孤雌胚分别在含6-DMAP和CHX的CM中培养1。h和3h时,1h处理组在分裂率（80．68％vs77．59％）和囊胚率（15．91％vs12．07％）上都略高于3h处理组。结果表明：兔卵母细胞经Ion处理5min,或先电激1次（参数为电压40V／mm,脉冲时间20μs,脉冲3次）,再用2mmol／L6-DMAP＋5mg／LCHX处理1～3h,均可获得较好的激活效果,有利于兔孤雌胚的发育。     

利用亮甲酚蓝染色法预测牛卵母细胞发育潜能的研究

利用亮甲酚蓝(Brilliant cresyl blue,BCB)对牛未成熟卵母细胞进行染色,根据染色结果的不同对牛未成熟卵母细胞进行分组培养,观察不同组间卵母细胞发育潜能与细胞凋亡的差异,探讨以BCB着色判定牛卵质量的可行性.本试验在牛卵母细胞成熟培养前用26μmol·L-1BCB染色90 min作为处理组(BCB+和BCB-),以未染色卵母细胞作为对照组;以卵内谷胱甘肽的浓度作为胞质成熟的判定指标,以卵母细胞体外受精后囊胚率作为卵子发育能力的判定指标,同时参照卵母细胞的凋亡检测,综合评定卵子的质量.结果表明:(1)着色组(BCB+)卵母细胞成熟率与对照组和无色组(BCB-)间差异显著(P＜0.05);(2)成熟卵母细胞中谷胱甘肽的浓度较培养前差异显著(P＜0.05);(3)经BCB染色,卵母细胞在成熟后,BCB+组的成熟率、凋亡率较对照组、BCB-组差异显著(P＜0.05);(4)体外受精后,BCB+组的囊胚率和囊胚细胞数较对照组和BCB-组差异显著(P＜0.05).由此可见,牛卵母细胞经BCB的染色选择可以作为判断卵母细胞未来发育潜能的一个标记.     

不同浓度雌二醇对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响

为了探讨雌二醇（17β-estrodiol,E2）对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎早期发育的影响,在卵母细胞体外成熟培养基中添加不同浓度雌二醇,研究卵裂率和囊胚率的变化。以未添加雌二醇的基础液为对照组,比较分析各组卵母细胞核成熟效率、孤雌激活后胚胎的卵裂率、囊胚发育率。结果表明,成熟液中添加1μg／mL雌二醇（E2）对猪卵母细胞的体外成熟具有明显的促进作用,而添加100μg／mL雌二醇（E2）对猪卵母细胞体外成熟具有明显的抑制作用。     

DNA Methylation Pattern in Pronuclear-Stage Mouse Embryos: Effect of Oocyte Vitrification

This study was conducted to investigate the pattern of DNA methylation in pronuclearstage mouse embryos derived from vitrified-warmed oocytes.Mouse oocytes at metaphase Ⅱ (MⅡ) stage of meiosis were all...     

Oocyte Transfer as an Analytical Tool:Vintage Experiments in Domestic Farm Animals

Four transplant studies are described that focus on fertilisation and early development or the progression of unfertilised oocytes (eggs) in the oviduct.(1) Pig eggs transplanted from ovulations induce...     

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.