影响动物克隆效率因素的研究进展

哺乳动物克隆效率低下成为目前制约动物克隆技术发展和应用的瓶颈。文章概述了动物克隆中供体细胞的选择、卵母细胞的去核方法、重构胚的激活和重构胚的培养等因素对克隆效率的影响以及提高克隆效率的策略，并对近年来影响动物克隆效率的因素作了详尽的论述，以期为该领域的科研工作者提供参考。     

山羊卵泡卵母细胞体外成熟的研究

研究了ＦＣＳ，１７β－Ｅ２，ＦＳＨ，ＬＨ对山羊卵泡母细胞成熟的作用，及培养时间对卵母细胞核和细胞质成熟的影响。结果表明，添加体积分数为１０％￣１５％的ＦＣＳ，１￣２ｍｇ·Ｌ＾－１ １７β－Ｅ２，２０￣５０ｍｇ·Ｌ＾－１ ＬＨ和１０ｍｇ·Ｌ＾－１ＦＳＨ有利于提高卵母细胞核成熟，并放出第一极体。     

玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究

为了提高玻璃化冷冻保存山羊卵母细胞的效果,试验用不含Ca2+的玻璃化冷冻液1[30%乙二醇(EG)]、玻璃化冷冻液2[27.5%EG+2.5%二甲基亚砜(DMSO)]和玻璃化冷冻液3(25%EG+5%DMSO)研究抗冻保护剂DMSO和EG的不同浓度配比对山羊卵母细胞形态正常率、孤雌激活率、体外受精卵裂率及胚胎发育能力的影响。结果表明:山羊卵母细胞经玻璃化冷冻液1,2,3处理后细胞形态正常率(97.1%、97.3%、97.3%)与对照组(100%)相比有所降低,但差异不显著(P>0.05),且对卵母细胞均不产生具有化学毒性作用的孤雌激活;山羊卵母细胞经3种玻璃化冷冻液冷冻保存后,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率(13.8%)显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%)(P<0.05)。说明采用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的效果。     

水牛卵母细胞孤雌激活方法的优化

为了研究离子霉素(Ion)在不同环境下对水牛孤雌激活效果的影响及水牛卵母细胞在6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)液中以聚集激活或分离激活方式对激活效果的影响。试验对比了水牛卵母细胞在25℃室温环境和38.5℃CO2培养箱环境下的Ion激活效果,还比较了水牛卵母细胞在6-DMAP液中进行聚集激活和分离激活的孤雌激活效果。结果表明:试验组8-细胞胚胎率(54.11%)和囊胚率(31.51%)均高于对照组的8-细胞胚胎率(51.68%)和囊胚率(27.52%),但无统计学差异;在6-DMAP液中分离激活组(1组)的囊胚率明显优于聚集激活组(2组)的囊胚率。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

PLCγ1基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响

旨在探究磷脂酶Cγ1（phospholipase Cgamma 1,PLCγ1）基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响,为揭示PLCγ1基因在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定基础。本研究选取包裹3层以上颗粒细胞的绵羊卵母细胞为试验材料,体外培养成熟后将其分为两组,利用显微注射技术将PLCγ1基因导入MⅡ期（减数第二次分裂中期）卵母细胞（n=127）中为试验组,以显微注射空载体pcDNA3.1-EGFP作为对照组（n=120）,经48 h后统计其卵裂率;并利用Ca²⁺探针Rhod 2-AM监测MⅡ卵母细胞和显微注射后16、48、72、96、120 h时各时期卵母细胞以及早期胚胎内Ca²⁺波动。结果显示,PLCγ1基因显微注射后卵母细胞被激活,卵裂率为（（19.67±0.2）%,P<0.01）,桑椹胚发育率为（（9.00±0.17）%,P<0.05）;PLCγ1基因注射后,卵母细胞和早期胚胎不同发育时期有Ca²⁺浓度变化,可观察发现Ca²⁺主要分布在胞质中且注射48 h时可达到峰值（P<0.01）。结果表明,PLCγ1基因可以引起绵羊卵母细胞发育过程中发生Ca²⁺振荡,启动其卵裂,并促使早期胚胎的继续发育。     

绵羊磷脂酶C-γ1对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞成熟率可作为衡量体外培养卵母细胞质量和发育能力的指标。本研究旨在探讨PLC-γ1是否参与了绵羊卵母细胞的体外成熟及其影响。将绵羊卵母细胞在含有不同浓度的U73122（PLC抑制剂））及m-3M3FBS （PLC激活剂）的成熟培养液中进行培养,每个浓度150个细胞,重复试验3次,统计细胞成熟率、卵裂率及桑葚胚率以供筛选出PLC-γ1的最佳抑制及促进浓度。qPCR检测0.5 μmol·L^-1 U73122及0.5 μmol·L^-1 m-3M3FBS处理后48 h的卵母细胞中PLC-γ1、BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6基因mRNA水平表达情况,Western blot检测0.5 μmol·L^-1 U73122及0.5 μmol·L^-1 m-3M3FBS处理后48 h的卵母细胞中PLC-γ1、BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6蛋白的表达情况。每个浓度150个细胞,重复试验3次。在绵羊卵母细胞中,0.5 μmol·L^-1 U73122是促进成熟的最佳浓度,0.5 μmol·L^-1 m-3M3FBS是抑制成熟的最佳浓度。0.5 μmol·L^-1 U73122处理组卵裂率和囊胚率均显著低于对照组。0.5 μmol·L^-1 m-3M3FBS处理组卵裂率和囊胚率均显著高于对照组。通过qPCR检测结果显示,与对照组相比,U73122组中BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53基因mRNA表达量显著上升,PLC-γ1、BCL6基因mRNA表达量显著下降;m-3M3FBS组则与之相反。Western blot结果显示,与对照组相比,U73122组中BAK、BAX、CASP8蛋白表达量显著增多,PLC-γ1、BCL6蛋白表达量显著减少,P53和CASP3蛋白表达量无明显变化。m-3M3FBS组中PLC-γ1、BCL6蛋白表达量显著增多,BAX、CASP3、P53蛋白表达量显著减少,BAK、CASP8蛋白表达量无明显变化。综上所述,本研究表明PLC-γ1在绵羊卵母细胞的体外成熟培养中发挥重要作用,其可调节卵母细胞的成熟以及早期胚胎的发育能力。     

O-GlcNAc修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响

旨在探究O-β-N-乙酰葡糖胺（O-linked beta-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc）修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响。本研究以牛卵母细胞为研究对象,检测O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）、O-GlcNAc糖苷酶（O-GlcNAcase,OGA）及O-GlcNAc蛋白在牛体外成熟卵母细胞中的分布;将卵丘-卵母细胞复合体分别在添加4 mmol·L^-1 OGT抑制剂BADGP和100 μmol·L^-1 OGA抑制剂PUGNAc的体外成熟液中进行体外成熟,将未添加组作为对照组,分别统计各组卵母细胞第一极体排出率和体外受精胚胎发育率,并采用荧光定量PCR和Western blot检测O-GlcNAc蛋白、OGT、OGA、GFAT和TXNIP的mRNA和蛋白表达。结果表明,OGT和O-GlcNAc蛋白共定位于牛体外成熟卵母细胞的细胞质和细胞核中,而OGA和O-GlcNAc蛋白共定位于体外成熟卵母细胞的细胞质中,且相对集中在卵母细胞的皮质区。与对照组相比,BADGP处理组和PUGNAc处理组卵母细胞第一极体排出率（（52.8±5.1）%&（60.9±1.9）%vs.（70.8±5.4）%）和体外受精囊胚发育率（（9.6±4.9）%&（10.0±5.8）%vs.（21.5±4.3）%）均显著降低（P<0.05）。BADGP处理显著降低了OGT的表达,使卵母细胞的O-GlcNAc修饰水平发生下调,OGA的表达降低;而在PUGNAc处理组中,卵母细胞OGA的表达显著下调,O-GlcNAc修饰水平升高,OGT的蛋白表达显著减少;抑制OGT显著上调己糖胺生物合成途径关键限速酶GFAT mRNA的表达,而抑制OGA则显著下调GFAT mRNA的表达;此外,O-GlcNAc修饰水平改变显著上调了葡萄糖调控关键因子TXNIP的表达。研究结果表明,O-GlcNAc修饰水平改变会降低牛卵母细胞体外成熟及发育能力,卵母细胞通过反馈调节OGT、OGA、GFAT以及TXNIP的表达,应对O-GlcNAc修饰水平的波动。     

黄体生成素对卵母细胞减数分裂恢复与排卵过程的分子机制研究进展

黄体生成素（LH）是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素,对卵泡的生长和排卵十分必要。哺乳动物卵母细胞阻滞在减数分裂I前期,卵母细胞中高浓度cAMP抑制减数分裂恢复。LH峰后,卵母细胞内cAMP水解,恢复减数分裂。卵母细胞成熟后,孕激素受体（PGR）、表皮生长因子（EGF）信号通路激活介导卵母细胞排卵。本文综述了LH诱导卵母细胞减数分裂恢复和排卵的相关机制,为进一步研究排卵过程的调控机制提供参考。