牛卵母细胞体外成熟技术研究

从两方面探讨了牛卵母细胞的体外成熟培养效果,即对不同级别和不同卵巢卵泡直径的卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行成熟培养,测定其成熟率。COCs级别不同,培养成熟率之间存在很大差异,A级COCs成熟率为63．81％,B级为47．81％,显著高于C级和D级（P〈0．01）。卵母细胞的成熟率与采集COCs时的卵泡直径关系密切。中等卵泡的卵母细胞的成熟率为61．82％,显著高于小卵泡和大卵泡（P〈0．01）。试验结果表明：A级和B级COCs是卵母细胞体外培养的主要资源;在卵母细胞体外培养过程中,宜选择卵泡发育水平基本正常的中等卵泡采集COCs,而不宜选择发育过大或过小的卵泡。     

牛不同直径卵泡内卵母细胞体外受精后的卵裂率和染色体异常分析

将不同直径牛卵泡内卵母细胞体外成熟培养22h后，对其体外受精后的卵裂率，胚胎发育速度和胚胎染色体异常发生率进行了研究。结果表明，体外受精后48h，直径3－6mm卵泡内卵母细胞外受精后的卵裂率明显高于直径1－2mm和7－10mm卵泡内卵母细胞体外受精后的卵裂率（P＜0．05）。体外受精后48h，直径3－6mm包泡内卵母细胞体外受精后的胚胎的发育速度明显快于直径1－2mm和7－10mm卵泡组胚胎（P＜0．05）。通过对不同卵裂期胚胎的染色体标本分析表明，直径1－2mm卵泡内卵母细胞体外受精后的胚胎染色体异常发生率明显高于直径3－6mm卵泡组（P＜0．05），但与直径7－10mm卵泡组之间无显著性差异。     

不同因素对牛卵母细胞体外成熟培养效果的影响

文章主要从采集方法、性周期阶段以及培养液中FBS浓度3个方面对牛卵母细胞体外成熟的影响进行了分析。结果表明：①不同采卵方法的采卵效果存在差异,但成熟培养和体外受精情况差异不显著（P〉0．05）;②从卵泡期和黄体期卵巢采集到的卵母细胞的体外成熟率和卵裂率分别,为59.7%,56．6％和39．5％、36．6％,没有显著差异（P〉0．05）;③培养液中添加20％FBS组的卵母细胞成熟率和卵裂率显著高于10%FBS和30%FBS组（P〈0．05）.     

卵丘细胞对辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,本试验以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。试验1,将一部分COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为机械裸卵(DOs),然后以4种方式培养,即COCs单独培养、DOs与COCs共培养(DOs(COCs))、DOs与卵丘颗粒细胞共培养(DOs(CCs)),以及DOs单独培养。试验2,根据包裹卵母细胞的卵丘细胞的完整性分为3组,有3层卵丘细胞紧密包围的卵母细胞复合体COCs3,有1-3层卵丘细胞包围的卵母细胞COCs1-3,无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞NOs,3组各自单独培养。结果表明:COCs组的成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率最高,分别为83.25%、41.75%和29.25%,卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育,COCs3组成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率分别为83.25%、42.50%和29.75%,显著高于COCs1-3和NOs组,卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育,自然裸卵已失去体外发育能力。     

牛性机能发育阶段与卵泡、黄体因素对卵母细胞

利用屠宰母牛卵巢,对来自不同性机能发育阶段母牛的卵巢卵母细胞、不同状态卵巢卵泡的卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）进行了系列研究。结果表明,来自初情期、性成熟母牛卵巢的卵母细胞受精后的卵裂率（７４．７％和８１．５％）、囊胚率（２３．０％和２６．８％）显著高于来自初情期前母牛卵巢卵母细胞的卵裂率（１８．８％）和囊胚率（１．８％）Ｐ〈０．０５;有黄体卵巢的卵母细胞体外受精后的发育能力显著     

猪分级卵母细胞体外成熟时间规律的研究

试验根据猪卵丘－卵母细胞复合体（COCs）的颗粒细胞层数,把COCs分成A、B、C和D级,A、B级用于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,C级用于体外分别培养24、32、38、44、48、54和60 h,观察它们不同时间排出极体数,然后将排出极体的卵母细胞孤雌激活。结果发现,A和B级COCs培养48 h时成熟率最高（83.2%和78.0%）,明显高于同级水平培养24、32和38 h的成熟率;不同级别COCs体外培养相同时间,A与B级成熟率差异不显著（P＞0.05）,但二者与C级的成熟率差异显著（P＜0.05）;体外培养48 h COCs卵裂率最高（81.7%）,与培养38 h前的卵裂率差异显著（P＜0.05）。结果表明,A、B级卵母细胞更适于体外培养,能获得高的成熟率和卵裂率,COCs周围颗粒细胞对卵母细胞的成熟有显著影响;COCs培养38 h之前,部分虽能看到极体,但激活后卵裂率极低,说明卵母细胞并未真正成熟,通常通过排出极体判断卵母细胞成熟是不够准确的,COCs体外培养44～48 h是成熟的最佳时期,能为体细胞核移植提供大量优质的MⅡ期卵母细胞。     

牛卵泡卵母细胞体外成熟的研究

研究了卵泡大小、卵泡液和卵丘细胞对牛卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明 :直径 2～ 6mm卵泡中的卵母细胞成熟率 ( 72 1%)最高 ,与直径小于 2mm( 5 8 4%)、6～ 8mm( 5 6 4%)及大于 8mm ( 3 5 0 %)卵泡中的卵母细胞组差异显著 ;成熟培养基中添加 10 %的新鲜牛卵泡液 (bFF)对牛卵母细胞的体外成熟有促进作用 ,但高浓度的bFF( 2 0 %、3 0 %)则抑制牛卵母细胞的体外成熟 ;卵丘 -卵母细胞复合体的质量影响卵母细胞的体外成熟 ,A、B、C三级卵母细胞成熟率分别为 86 1%、66 3 %、3 5 6%,卵裂率分别为 42 8%、3 1 9%、10 5 %,差异均显著 (P <0 0 5 )。     

能量水平和来源对后备母猪卵母细胞质量及相关基因表达的影响

选择初始体质量（59&#177;4．2）kg的长白&#215;大白杂交母猪54头,采用3&#215;2试验设计,研究日粮能量水平和来源对后备母猪卵泡发育和卵母细胞体外成熟以及排卵前卵丘-卵母细胞复合物（COCs）中生长分化因子-9（GDF-9）、骨形态发生蛋白-15（BMP-15）、促黄体素受体（LHR）、促卵泡素受体（FSHR）mRNA表达的影响。3个能量水平分别为NRC推荐能量需要的87．5％、100％和112．5％;每个能量水平分别以淀粉和油脂为主要能量来源。试验母猪在第2个发情期的第19天屠宰。结果表明：随能量水平升高,大卵泡数增多（P〈0．05）,能量来源对卵泡数量没有显著影响（P〉0．05）;高能量水平下卵丘扩散程度（P〈0．05）和卵母细胞成熟的比例最高（P〈0．01）,能量来源对卵丘扩散程度影响差异不显著（P〉0．05）,淀粉组卵母细胞成熟的比例高于油脂组（P〈0．05）;基因分析表明,饲喂低能量水平组的GDF-9和BMP-15mRNA的表达量最高（P〈0．05）,淀粉组上调GDF-9mRNA的表达（P〈0．05）,能量来源对BMP-15mRNA表达影响差异不显著;各处理小卵泡的卵丘-卵母细胞复合物中GDF-9和BMP-15mRNA表达量高于大卵泡（P〈0．01）;高能量水平组的LHR和FSHRmRNA表达量最高（P〈0．05）,能量来源对大卵泡卵丘-卵母细胞复合物中FSHRmRNA表达无显著影响,淀粉组上调LHRmRNA表达（P〈0．05）。研究表明,提高日粮能量水平增加母猪排卵前大卵泡数量和卵母细胞成熟的比例,以淀粉为能量来源对卵泡数量没有显著影响,但提高了卵母细胞成熟的比例;能量影响卵泡数量和卵母细胞成熟可能与GDF-9、BMP-15和LHR、FSHRmRNA表达有关。     

EGF和IGF-I对绵羊卵母细胞体外成熟和卵裂的影响

本文研究了EGF、IGF-I以及EGF和IGF-I联合对绵羊卵母细胞体外成熟和卵裂的影响,以确立绵羊卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明：50ng／mL的EGF的成熟率和卵裂率分别为71．2％和45．5％,显著高于对照组和10、20、30、40ng／mL组（P〈0．05）,当EGF浓度达到100ng／mL时,成熟率和卵裂率最高,分别为72．9％和45．7％;40ng／mL IGF-1的成熟率和卵裂率分别为70．7％和58．5％,显著高于对照组和10、20、60、80、100ng／mL组（P〈0．05）,当IGF-I的浓度为100ng／mL时,成熟率和卵裂率最低,分别为38．8％和20．0％,与对照组和其它各试验组差异显著（P〈0．05）;50ng／mLEGF和40ng／mLIGF-I联合使用,成熟率和卵裂率分别为85．6％和61．0％,同对照组和50ng／mLEGF组、40ng／mLIGF-I组之间差异显著（P〈0．05）。     

牛性机能发育阶段与卵泡、黄体因素对卵母细胞体外成熟及体外受精的影响

利用屠宰母牛卵巢．对来自不同性机能发育阶段母牛的卵巢卵母细胞．不同状态卵巢卵泡的卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）进行了系列研究。结果表明．来自初情期、性成熟母牛卵巢的卵母细胞受精后的卵裂率（ ７４． ７％和 ８１． ５％）、囊胚率（ ２３．０％和 ２６． ８％）显著高于来自初情期前母牛卵巢卵母细胞的卵裂率（１８．８％）和囊胚率（１．８％）,Ｐ＜０．０５;有黄体卵巢的卵母细胞体外受精后的发育能力显著低于无黄体卵巢卵母细胞（卵裂率５８．０％：７９． ９％,囊胚率１３．％：２７．１％,Ｐ＜０．０５）;优势卵泡的有无对卵母细胞的卵裂率和囊胚率无明显影响。     

输卵管和颗粒细胞单层对牛体外受精胚胎发育的影响

以屠宰场牛卵巢为试验材料,研究输卵管细胞单层(OCM)和颗粒细胞单层(GCM)对牛卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)后胚胎发育能力的影响。(1)从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3类:1级(≥4层);2级(2～3层);3级(0～1层)。作分别在IVM和IVC培养液中添加GCM(1×106个/mL)与不添加的对比试验。结果显示:添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率无明显影响(P>0.05);但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。(2)所有卵母细胞(包括COCs和裸卵)被随机分为3个组,在其IVM和IVC培养液中分别添加OCM、GCM或不添加体细胞(对照组)。结果显示:OCM和GCM组的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率均高于对照组(P<0.05),而两试验组之间差异不显著。     

胰岛素对犬卵母细胞体外成熟的影响

研究不同浓度胰岛素及不同培养时间对犬卵母细胞体外成熟率的影响,为改善犬卵母细胞体外培养体系提供参考,采用切割法收集卵巢表面卵丘—卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes, COCs),在含有0.6%葡萄糖的TCM199中添加不同浓度的胰岛素（0、3、6、9 IU/mL）,38.5 ℃、5% CO₂培养箱内成熟培养,观察卵丘扩散程度,剥离卵丘细胞获得裸卵后,室温下固定15 min;Hoechst 33342染色,压片,荧光显微镜下观察核形态,用SPSS 14.0软件统计试验数据。不同浓度胰岛素培养48 h后,各组卵丘细胞扩散效果都不明显;卵母细胞核成熟期没有达到减数分裂中期（MⅡ）,但是6 IU/mL胰岛素组生发泡破裂期（GVBD）比率（35.88%±14.63%）显著高于对照组（11.25%±9.75%）;6 IU/mL胰岛素组延长培养时间至72和96 h后,MⅠ-MⅡ期卵母细胞成熟率分别为13.33%±1.5%、20.8%±1.9%。以上结果表明,犬体外成熟培养基中添加胰岛素既没有提高犬卵母细胞核成熟到MⅡ期,也没有改善犬卵母细胞卵丘扩散效果。但是,在6 IU/mL浓度下延长培养时间,相对增加了成熟率。     

绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟及孤雌发育影响的研究

本研究探讨绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟和后期发育的影响。实验分为4组,对照组为卵丘-卵母细胞复合体(COCs);裸卵(DO)组;COCs与DO共培养组(CODO);卵丘细胞(CC)与DO共培养组(CCDO)。体外成熟培养18 h后,检测各组卵子成熟质量并进行孤雌发育研究。结果表明:CODO和CCDO组中裸卵活率显著高于DO组(P<0.05),但显著低于COCs组(P<0.05),且COCs组中卵子活率极显著高于DO组(P<0.01);在极体排出率方面,CODO、CCDO和DO3组差异不显著(P>0.05),但是它们都显著低于COCs组(P<0.05)。COCs、CODO、CCDO和DO 4组卵裂率差异均不显著(P>0.05)。然而,DO组的囊胚率显著低于CODO和CCDO组(P<0.05),极显著低于COCs组(P<0.01),但CODO和CCDO 2组中裸卵的囊胚率差异不显著(P>0.05)。总之,无论散在的卵丘细胞还是COCs均能提高裸卵体外成熟及后期发育潜力。     

牛卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

试验以牛卵泡内卵丘-卵母细胞复合体(COCs)为材料,探讨了牛卵丘细胞包裹程度对卵母细胞体外成熟(IVM)和孤雌胚胎(PAEs)发育的影响。试验1,将COCs随机分为2组,在开展IVM前,将其中一组COCs的卵丘细胞机械吹打去除成为机械裸卵(DOs),研究卵丘细胞层存在与否对卵母细胞体外核成熟(排出第一极体)和孤雌激活后发育能力的影响;试验2,根据COCs卵丘细胞包裹层数将COCs分为3组,即卵丘细胞层少(1～4层)的COCs为A组、卵丘细胞层多(5层以上)的COCs为B组及包裹5层以上卵丘细胞且附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)的COCs为C组,研究卵丘细胞层包裹程度对卵母细胞的体外核成熟和孤雌激活后胚胎发育能力的影响。结果表明:卵丘细胞的存在更有利于卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育;COCs中卵丘细胞包裹层数对卵母细胞体外核成熟率没有显著影响,但包裹卵丘细胞层数多且附带FSP的卵母细胞,其PAEs的囊胚率显著高于包裹卵丘细胞少的卵母细胞PAEs。     

甘氨酸对猪卵母细胞体外成熟质量及卵丘细胞的影响

本实验旨在研究甘氨酸对卵丘细胞及卵母细胞体外成熟质量的影响,优化猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养体系。在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加6 mmol/L甘氨酸,体外培养至44 h后,通过倒置显微镜测量卵丘细胞扩散直径,结合流式细胞术与qPCR检测卵丘细胞凋亡情况;进一步检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽(GSH)、细胞成熟促进因子(MPF)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)水平及细胞成熟相关基因表达。结果表明:甘氨酸能显著提高卵丘细胞扩散直径,减少卵丘细胞的总凋亡率,并能显著提高卵丘细胞中Bcl-2的mRNA表达;甘氨酸能显著增加成熟卵母细胞中的GSH、MPF和MAPK水平以及成熟相关基因BMP15、GDF9、CyclinB1、CDK1、C-MOS的mRNA表达。综上可知,甘氨酸可提高猪卵母细胞体外成熟质量,降低卵丘细胞凋亡率。     

Developmental competence of heat stressed oocytes from Holstein and Limousine cows matured in vitro

The negative effects of heat stress on dairy cattle's fertility have been extensively studied, but the relevant knowledge for beef cattle is rather limited. The aims of this study were to investigate the effects of HS during in vitro maturation on the developmental potential of oocytes derived from Limousine and Holstein cows and to estimate the effect of the differential gene expression of important genes in oocytes, cumulus cells and blastocysts in the growth competence between the breeds. In seven replicates, cumulus oocyte complexes from Holstein and Limousine cows were matured for 24 hr at 39°C (controls C; Hol_39, Lim_39) or at 41°C from hour 2 to hour 8 of IVM (treated T; Hol_41, Lim_41), fertilized, and presumptive zygotes were cultured for 9 days at 39°C. Cleavage and embryo formation rates were evaluated 48 hr post-insemination and on days 7, 8 and 9, respectively. From all groups, subsets of cumulus cells, oocytes and blastocysts were analysed for the relative expression of genes related to metabolism, stress, apoptosis and placentation. No difference was detected in cleavage rate or in blastocyst formation rate among the control groups. In both breeds, heat stress reduced blastocyst yield, but at all days the suppression was higher in Limousines. In Holsteins, altered gene expression was detected in cumulus cells (G6PD, GLUT1) and blastocysts (PLAC8), while in Limousines, differences were found in oocytes (G6PD, HSP90AA1), in cumulus cells (CPT1B, HSP90AA1, SOD2) and blastocysts (DNMT, HSP90AA1, SOD2). It appears that Holstein COCs are more tolerant than Limousine COCs, possibly due to compulsory, production driven selection.     

Influence of co‐culture with denuded oocytes during in vitro maturation on fertilization and developmental competence of cumulus‐enclosed porcine oocytes in a defined system

Co‐culture of cumulus‐oocyte complexes (COCs) with denuded oocytes (DOs) during in vitro maturation (IVM) was reported to improve the developmental competence of oocytes via oocyte‐secreted factors in cattle. The aim of the present study was to investigate if addition of DOs during IVM can improve in vitro fertilization (IVF) and in vitro culture (IVC) results for oocytes in a defined in vitro production system in pigs. The maturation medium was porcine oocyte medium supplemented with gonadotropins, dbcAMP and β‐mercaptoethanol. Cumulus‐oocyte complexes were matured without DOs or with DOs in different ratios (9 COC, 9 COC+16 DO and 9 COC+36 DO). Consequently; oocytes were subjected to IVF as intact COCs or after denudation to examine if DO addition during IVM would affect cumulus or oocyte properties. After fertilization, penetration and normal fertilization rates of zygotes were not different between all tested groups irrespective of denudation before IVF. When zygotes were cultured for 6 days, no difference could be observed between all treatment groups in cleavage rate, blastocyst rate and cell number per blastocyst. In conclusion, irrespective of the ratio, co‐culture with DOs during IVM did not improve fertilization parameters and embryo development of cumulus‐enclosed porcine oocytes in a defined system.