犬2型腺病毒SY株的致弱驯化

作者对分离和系统鉴定的一株犬传染性喉气管炎病毒（犬2型腺病毒）SY（沈阳）株，用犬肾传代细胞MDCK进行了致弱驯化，每驯化15代做一次初步的犬的安全性试验。用大剂量不同代次病毒对易感犬进行人工感染试验，每天观察犬的临床症状及白细胞总数，并于接毒后的第5d安乐死，作病理解剖学和病理组织学检查，易感犬的感染试验结果表明，SY株在犬贤细胞上传15代时对犬的致病力已降低，30代时对犬已不引起发烧，精神沉郁和厌食等症状，仅引起轻度的鼻炎，中度的咽炎，剖检肺表现正常，仅见支气管淋巴结肿大，45代时无临床症状，剖检除扁桃体肿大外没有见到其它症状，60代毒已完全失去致病力，未见任何临床症状及病理变化。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

H5亚型虎源流感病毒血凝素单抗制备及胶体金试纸条的研制

以H5N1亚型虎源流感病毒免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得2株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为3A13和1B8.分别制备腹水后进行纯化,获得了抗H5亚型虎源流感病毒血凝素的单克隆抗体,用制备的单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术,制备了H5亚型虎源流感病毒免疫胶体金快速诊断试纸条.该试纸条对H5N1虎源流感病毒鸡胚培养毒、H5亚型禽流感病毒标准抗原,以及24份虎疑似感染H5N1亚型虎源流感病毒感染病料和小鼠模型病料等检测结果为阳性,同时对H7和H9亚型禽流感病毒标准抗原及传染性支气管炎、新城疫抗原等检测结果为阴性;与HA-HI和RT-PCR的平行对比试验表明,试纸条检测敏感度与血凝试验和血凝抑制试验的敏感性相符.本试验所研制的免疫胶体金诊断试纸条可用于H5亚型虎源流感病毒的特异诊断和流行病学调查,为开发成品化检测试纸条奠定基础.     

犬冠状病毒YS1株在DK细胞上蚀斑形成方法的建立及其克隆纯化

犬冠状病毒 ( CCV)是引起犬发生冠状病毒性肠炎的一种重要病原 ,由于该病毒在普通细胞上培养需较长时间 ( 3～ 6天 )才出现病变 ,且病变不明显 ,不易观察 ,难以广泛开展该病毒的鉴定、克隆、滴定及中和抗体的检测等研究工作。本实验以琼脂糖作为覆盖物 ,在 DK细胞上 ,对该病毒蚀斑的形成条件进行了摸索 ,建立了犬冠状病毒的蚀斑形成方法 ,并以该方法进行了 CCV YS1株的克隆纯化 ,结果较为理想 ,现报告如下。1　材料与方法1 .1　病毒株　犬冠状病毒 YS1株 ,从 CCV肠炎犬病料中分离获得 ,人工感染犬试验 [1]表明其为一株免疫原性良好的…     

犬瘟热病毒的蚀斑克隆试验

对血清、胰酶以及染色时间等可能影响犬瘟热病毒蚀斑形成的条件进行了摸索。结果发现,对必须同步接毒的CDV小熊猫（LP）株来讲,其形成蚀斑的最佳条件是：同步接毒10h后,加入血清含量的2%的无酚红的DMEM营养琼脂,第5d时,加入1/5体积的胰酶含量为1/8000的含中性红的DMEM营养琼脂染色,于第6d时,便可形成蚀斑。挑选不同大小的蚀斑,克隆3次后,获得了蚀斑直径为0.4～0.6,0.6～0.8及0.7～0.9mm的克隆株各一个。     

犬冠状病毒YS1株人工感染犬试验

使用从腹泻犬体内分离获得的犬冠状病毒ＹＳ１第５代ＣＲＦＫ细胞培养物,以不同剂量人工感染５０只２￣３月龄健康幼犬 ,１４ｄ内计有１６只犬发病,其中１４只耐过,２只死亡,发病率为３２％,死亡率为１２．５％,患犬粪便经电镜检查和ＲＴ－ＰＣＲ检测,前者见有ＣＣＶ样病毒,后者扩增出ＣＣＶ特异核酸片段。４８只试验犬血清对该病毒的ＳＮ抗体效价随接毒量的不同分别平均为１：３１０、１：２４５、１：１８５、１：１１５     

犬2型腺病毒毒株纤突蛋白基因的比较分析

根据GenBank中犬腺病毒（canine adenovirus,CAV)纤突基因序列，设计合成2对引物。用PCR方法，对犬2型腺病毒沈阳分离株（CAV-2SY株）第5代强毒（SY-V5）、经蚀斑克隆驯化的第60代毒弱毒（SY-V60）、SY-V60感犬体上传5代的回收毒（SY-CP5）、美国疫苗毒（US-V20）等4个毒株的纤突基因进行了扩增，PCR产物经纯化后进行基因序列测定，测序结果经拼接后得到1个由1629个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列，编码543个氨基酸。犬2型腺病毒与GenBank中的标准的CAV-2强毒株（Toronto A26/61)纤突蛋白基因序列的比较结果表明：CAV-2SY株强毒株与Tornto A26/61株相同；SY-V60株与SY-CP5相同，与驯化前的SY-V5相比，在1134位发生碱基颠换，编码的氨基酸由原来的天冬酰氨（N）变为赖氨酸（K），并导致N-X-S/T潜在糖基化位点发生改变，US-V20该部位与发生同样的突变，本试测定和比较的CAV-2强毒株有5个潜在的N-联糖基化位点，弱毒株仅有4个位点；US-V20与TorontoA26/61差异较大，有11个碱基发生变化，导致8个氨基酸的变异。     

犬冠状病毒V1株核蛋白基因的克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒V1野毒株核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N基因序列,设计了1对特异性引物,对分离的CCV V1野毒株进行了RT—PCR扩增;将扩增得到的阳性PCR片段经纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN1,进行核苷酸序列测定,并与GenBank中CCV标准毒株Insavrc—1 N基因进行了比较。结果该基因全长为1146bp,编码382个氨基酸,两者核苷酸的同源性为91．7％;推导的氨基酸序列的同源性为90．2％,显示出较高的保守性。在V1野毒株推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒相应区域相同,推测可能是RNA结合区。另外,推导的该蛋白氨基酸序列其疏水性和抗原表位与标准毒株Insavc-1 N蛋白存在一定的差异;在氨基酸组成上,该蛋白丝氨酸和赖氨酸含量高达9．84％,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构：     

犬冠状病毒基因重组抗原间接ELISA检测方法的研究

以在E、coli高效表达的犬冠状病毒核蛋白为抗原，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗犬IgG为二抗，建立了检测犬冠状病毒抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定确定出最佳反应条件为lμg／孔纯化的E．coli表达的重组N蛋白抗原包被酶标板，用10％的兔血清进行封闭，以正常E．coli裂解上清液稀释待检血清。结果表明：应用重组N蛋白作为诊断用抗原具有特异性强、稳定性高、成本较低等特点。     

动物干扰素的研究进展

1980年国际干扰素委员会定义了干扰素：干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的蛋白质,其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制,涉及RNA和蛋白质的合成。本文就动物干扰素的研究现状做以概述,为动物干扰素的研究奠定理论基础。