海洋源芽孢杆菌的分离鉴定及其消化酶代谢产物的测定

【目的】从海洋生物和环境中分离鉴定出产消化酶代谢产物的芽孢杆菌,为微生态制剂的研制提供益生菌种。【方法】从雷州半岛近岸海域采集样品,用高温处理、富集培养和分离培养的方法获得分离菌株;通过菌落形态、细胞结构、染色特征、生化试验和16S rRNA基因测序对分离菌株进行鉴定;采用福林-酚比色法、淀粉-碘比色法和橄榄油乳化法测定分离菌株代谢产物中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。【结果】从22份样品中初步鉴定出疑似芽孢杆菌43株,筛选3种消化酶综合活性最强的8株,经生化试验和16S rRNA基因测序鉴定,有蜡样芽孢杆菌3株、暹罗芽孢杆菌3株、特基拉芽孢杆菌1株、解木糖赖氨酸芽孢杆菌1株。其中,解木糖赖氨酸芽孢杆菌BC1产脂肪酶活力最高,为52.13 U/mL;蜡样芽孢杆菌BC3产蛋白酶活力最高,为4.78U/mL;暹罗芽孢杆菌BC6产淀粉酶活力最高,为2.35 U/mL。【结论】成功筛选出产消化酶代谢产物的海洋源芽孢杆菌。     

防褐化处理对蒙古栎插穗生根及其生理生化的影响

研究防褐化处理对蒙古栎嫩枝扦插生根的影响。以蒙古栎3年实生苗的嫩枝为材料,分别采用乙醇、硝酸银、抗坏血酸对插穗进行防褐化处理,采用500 mg·L^-1 IBA-K浸蘸处理后扦插,并分别在扦插后0、10、20、30、40、50 d取样测定不同生根时期氧化蛋白酶活性和内源激素含量。结果表明,防褐化处理可有效提高扦插生根率,以1%乙醇1 h+500 mg·L^-1 IBA-K处理2 h最佳,生根率、根系效果指数分别为21.1%和5.713。在生根过程中,外施500 mg·L^-1 IBA-K能够提升插穗内POD、PPO的活性,降低IAAO的活性,且IAA/ABA、IAA/ZR的比值升高,有利于蒙古栎嫩枝扦插生根。由此说明1%乙醇1 h浸泡结合500 mg·L^-1 IBA-K激素处理,通过提高POD与PPO的活性,可降低IAAO的活性,增加IAA/ZR和IAA/ABA的比值,提升蒙古栎嫩枝扦插成活率。     

利用牡蛎制作海鲜调味汁的试验

研究了混合酶水解牡蛎蛋白质的技术条件，并和单酶水解结果进行了比较。结果表明，混合酶水解可提高水解率和水解液中氨基态氮(AAN)的含量，同时改善了水解液风味。     

中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂C基因的原核表达

为了研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)的功能并探索其在水产品加工和病害防治中的应用潜力，将改造后的中华鲟(Acipenser sinensis)cystatin C cDNA亚克隆到原核表达载体pBV220，构建表达cystatinc的大肠杆菌基因工程菌。该工程菌经温度诱导、SDS—PAGE检测，在约12．4kD处有一特异蛋白带，该特异蛋白的含量约为菌体总蛋白的25％。重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂经洗涤、溶解、透析、复性后纯度为85％，实现了中华鲟cystatinC在大肠杆菌中的高效表达。木瓜蛋白酶活性抑制实验结果表明该重组cystatinc具有明显的酶活抑制作用。     

欧鳗黑仔苗在不同盐度条件下生长效果的比较

本实验主要研究欧鳗黑仔苗在盐度分别为0、5、10和15的水体中的生长差异.实验结果表明,盐度对欧鳗黑仔苗的生长和体内蛋白酶活性具有显著的影响(P＜0.05);对欧鳗黑仔苗的成活率没有影响(P＞0.05);对欧鳗黑仔苗的总摄食量、饵料系数有显著的影响(P＜0.05).盐度为10时生长速度最快,饵料系数最低.     

Purification and characterization of stomach protease from the turbot (Scophthalmus maximus L.)

Proteolytic activity in the different parts of the digestive tract of the turbot (Scophthalmus maximus L.) were studied in this work. One pure protease was isolated from turbot stomach and its behavior was studied. Results showed the optimum pH for proteases in the different parts of the digestive tract of the turbot were pH 2.0 for the stomach, pH 8.0 for the pylorus cecum, pH 8.0 for the foregut, pH 8.5 for the midgut, and pH 8.0 for the hindgut. The activity of proteases in the different parts of the digestive tract were in the sequence pylorus cecum protease > stomach protease > foregut protease > midgut protease > hindgut protease. The stomach protease was purified by ammonium sulfate precipitation and column chromatography on DEAE-Sepharose F.F. and Sephadex G-100. The purified enzyme gave a single band in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Its molecular weight was found to be approximately 42,000 Da. The enzyme is stable at pH 1.0–9.0 and at temperatures below 40°C. Its activity was maximum at pH 2.0 and 40°C. When reaction time was prolonged the optimum temperature of the enzyme tended to decline. The enzyme was activated by Mn²⁺ and Cu²⁺ and inactivated by Fe³⁺. It was fully inhibited by pepstatin and partially inhibited by PMSF, TPCK, PCMB, and NBS. These results imply the enzyme is a pepsin.     

海洋低温蛋白酶生产菌YS-9412-130原生质体的制备与再生

以海洋低温蛋白酶生产菌株YS-9412-130为研究对象，从传代、菌龄、溶菌酶浓度与酶解时间、甘氨酸与EDTA预处理以及稳定剂对该菌原生质体形成与再生的影响进行研究。结果表明，在相同条件下，第一代菌至第五代菌原生质体的形成率分别为86．9％、70．3％、66．8％、63．4％、60．2％，再生率分别为10．5％、18．6％、17．9％、18．2％、17．8％；取该菌对数生长前期、对数生长中后期、稳定期部分菌液制备原生质体，原生质体的形成率分别为72．1％、70．4％、60．5％，再生率为13．4％、18．9％、10．4％；溶菌酶浓度为2．5mg／mL、5mg／mL、10mg／mL、20mg／mL，酶解60min，原生质体的形成率分别为40．6％、70．8％、81．8％、95．6％，原生质体的再生率为19．0％、19．2％、19．0％、10．6％；使用10mg／mL溶菌酶酶解YS-9412-130菌30min、60min、90min、120min，原生质体的形成率分别为30．8％、81．3％、81．7％、82．9％，原生质体的再生率分别为19．2％、19．3％、16．9％、11．2％；在细菌培养液中添加终质量浓度为5mg／mL、10mg／mL、20mg／mL和40mg／mL的甘氨酸，培养该菌16h后制备原生质体，原生质体的形成率分别为81．0％、81．1％、90．3％、90．8％、90．6％，再生率为19．1％、19．0％、19．3％、12．0％、9．0％；EDTA对原生质体的形成稍有促进作用，但作用超过30min会影响原生质体的再生；分别以0．6mol／L Kcl、0．3mol／L KCl＋0．3mol／L蔗糖、0．6mol／L蔗糖作为稳定剂，原生质体的再生率分别为10．9％、19．6％、25．9％。结论认为，YS-9412-130原生质体制备的最佳条件为选用第2代YS-9412-130菌，在培养基中添加终质度浓度为10mg／mL的甘氨酸培养16h后，再将菌体置于含有0．05mol／LEDTA的高渗溶液中30℃预处理30min，用10mg／mL溶菌酶，30℃酶解60min，再用0．6mol／L蔗糖作为原生质体再生培养稳定剂，比较适合于YS-9412-130原生质体的制备与再生。这一试验结果将为通过原生质体技术对YS-9412-130菌进行遗传改良提供重要参数。     

Characterization of chymotrypsin activity during early ontogeny of larval red drum (Sciaenops ocellatus)

The temporal evolution of chymotrypsin activity during early ontogeny of laboratory reared red drum larvae was accomplished using a combination of biochemical assays and electrophoretic methods (substrate SDS-PAGE). Optimal functional conditions for chymotrypsin were also determined. Chymotrypsin activity was first detected prior to the onset of exogenous feeding. Total chymotrypsin activity increased with age and standard length. Specific activity was greatest on day 10 post-hatch. Maximal chymotrypsin activity was observed at 50 °C, pH 7.8, and Ca²⁺ concentration of 25 mM. Using substrate gel electrophoresis and specific inhibitors the molecular weight of red drum chymotrypsin was estimated to be 26–27 kD. Our results indicate that the digestive system of red drum larvae is capable of alkaline proteolysis before first feeding and suggest that chymotrypsin may have potential as an indicator of nutritional condition.     

养殖刺参溃疡病杀鲑气单胞菌的分离、致病性及胞外产物特性分析

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参的LD50为5.24μg蛋白/g体质量。H1-ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、几丁质酶和淀粉酶活性,并具有溶血素活性;对底物偶氮酪蛋白(Azocasin)作用的酶比活力可达到674.5活力单位/mg蛋白,最适作用温度为50℃;对热不稳定,70℃作用30 min时,酪蛋白酶活性降到0;100℃作用30 min,ECP对刺参的毒性消失;ECP酶活可被10 mmol/L EDTA完全抑制,可被5 mmol/L PMSF抑制98.8%,Ca2 和Mg2 可使酶活性分别提高约9%和4%。结论认为,该病原菌通过体表创伤侵入方式感染宿主刺参,菌株H1胞外产物是其对刺参致病的因子之一。