Detection of protease genes in field soil applied with liquid livestock feces and speculation on their function and origin

The origin of soil protease in field soil was estimated using culture-dependent and independent approaches. Overall soil protease activity was much higher in field soils with an annual application of liquid livestock feces (120 t ha⁻¹ year⁻¹ and 600 t ha⁻¹ year⁻¹) compared with the activity recorded in other field soils, and the character of the soil proteases became highly homogeneous (approximately 70% metalloprotease in a 600 t field). Selective incubation studies suggested that bacteria were the most important source of soil protease. There were significantly higher correlations between serratial metalloprotease and the overall soil protease in both feces-applied fields in terms of the effect of inhibitors, and the bacteria, which produced serratial metalloprotease, were suggested to proliferate in both the 120 t and 600 t fields. The gene homologous to serratial metalloprotease gene was amplified in directly extracted DNA from field soils using selective DNA primer and proteolytic Serratia marcescens was certified to be one source of soil protease in these field soils. Proteolytic S. marcescens and its metalloprotease gene have occasionally been isolated and detected in field soils applied with raw feces, and have rarely been isolated or detected from other field soils. Proteolytic S. marcescens is believed to be introduced in the raw feces and subsequently colonizes the field soil and replaces the indigenous bacteria in the soil.     

大丽轮枝菌菌体对链霉菌胞外蛋白酶活性及抑菌效果的影响

 为研究拮抗链霉菌对棉花黄萎病原大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）的抑菌机理,以大丽轮枝菌菌体为唯一碳氮能源,采用液体培养法及生长速率法研究供试病原菌菌体对4株拮抗链霉菌胞外蛋白酶合成的诱导作用及抑菌活性物质产生的影响。结果表明：大丽轮枝菌菌体可以诱导供试链霉菌合成蛋白酶;诱导粗酶液对病原真菌菌丝有溶解作用;当菌体添加量为10 g·L^-1,28℃培养7 d时菌株Z13蛋白酶活性高达4.24 U;以大丽轮枝菌菌体为碳氮能源时供试链霉菌能产生活性较强的抑菌物质;当菌体添加量为20 g·L^-1,发酵液稀释5倍时菌株B49所产抑菌活性物质的最大抑菌率达95.7%。     

油茶籽油的蛋白酶水解法提取工艺研究

采用物理破碎油茶籽细胞和酶降解相结合的方法提取油茶籽油,对油茶籽原材料的预处理时间和温度,酶解方法进行了研究,探索蛋白酶在水性条件下酶解油茶籽的提油工艺及其影响因素,结果表明:油茶籽原材料预处理的适宜加热温度为90℃、加热时间为2 h,适宜的酶解温度为38℃、pH值为8、水解酶用量为0.25%(占油料的质量比重)、酶解时间为4 h。     

土地利用方式对球囊霉素土层分布的影响

球囊霉素对维持土壤有机碳平衡和土壤团聚体稳定性具有明显作用,但不同土地利用方式下土壤球囊霉素的土层分布模式及其影响因素尚不清楚.本研究选取农田、人工草地、果园和撂荒地4种不同土地利用方式,分别采集0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm和30～40 cm 4个土层土样,通过测定土壤球囊霉素.pH、速效磷、有机碳和蛋白酶活性,研究不同土地利用方式下土壤球囊霉素土层分布的模式及影响因素.结果表明,土壤球囊霉素平均含量为1.41～3.18 mg·g-1,占土壤有机碳的6.98%～31.34%,是土壤中的一个重要碳库.土壤球囊霉素在不同土地利用方式和土层剖面之间表现出显著差异(P<0.01),具有明显的垂直分布特征,除撂荒地外,其随土层深度的增加表现出降低趋势.土壤球囊霉素分别与土壤速效磷、蛋白酶呈显著正相关(P<0.01).土壤速效磷在很大程度上决定土壤球囊霉素的含量和分布.土壤球囊霉素含量和土壤蛋白酶活性之间为间接相关关系,该关系有待于进一步研究.建议把球囊霉素作为研究丛枝菌根真菌生长状况和土壤生态系统波动的一个重要指标.     

斑点叉尾鮰鱼肠蛋白酶的分离纯化及其酶学性质

以斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus鱼肠道为原料提取蛋白酶,对分离条件进行了优化,并对部分酶学性质进行了研究。结果表明：鱼肠内的蛋白酶在硫酸铵饱和度为70%时,所得沉淀中酶活力最高。经过阴离子交换层析分离后,蛋白酶的纯化倍数达到了218倍。该蛋白酶的最适温度为55℃,最适pH为7.5,具有良好的低温稳定性和酸碱稳定性,米氏常数为5.4 g/L。K^＋和Ca^2＋离子对该蛋白酶活性有较弱的激活作用,Mg^2＋则能显著激活蛋白酶活性;Na＋和Zn2＋对蛋白酶的活性有较弱抑制作用,而Cu^2＋和EDTA能显著抑制蛋白酶活性。     

枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果

为开发以鱼粉为原料的优质饲料蛋白源以及相关保健食品,开展了用不同鱼粉为氮源发酵枯草芽孢杆菌生产蛋白酶及其酶解效果的研究,比较了不同菌种的发酵效果,确定了最佳发酵时间.通过蛋白酶活性测定和氨基态氮含量测定分析了不同菌种的产酶能力和酶活性大小及其酶解效果.结果表明,用罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵商业化的工业菌种枯草芽孢杆菌产生的酶活性显著高于鲢鱼鱼粉（P〈0.05）,发酵后上清液中的氨基态氮含量也显著高于鲢鱼鱼粉（P〈0.05）,即工业化的枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果不同,罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.     

月季花瓣丝氨酸蛋白酶基因RhSep1的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术,从切花月季品种"Samantha"中克隆丝氨酸蛋白酶基因RhSep1。利用生物信息学技术对所得到的丝氨酸蛋白酶RhSep1序列进行结构与功能预测。结果表明:RhSep1基因全长2 442 bp,开放阅读框编码769个氨基酸,推定该丝氨酸蛋白酶分子质量为80.48 kD。通过NCBI和MEROPS肽酶数据库等对Rh-Sep1进行Protein Blast,发现RhSep1具有肽酶S8₃家族SA的典型结构域Petidase_S8₃（序列为Tyr-108-Leu-341）和PA_subtilisin_like的结构域（序列为Tyr-348-Ile-474）。预测RhSep1可能具有信号肽、明显疏水区和典型跨膜区,同时RhSep1氨基酸序列中存在较多蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、豆蔻酰化位点。这些活性位点往往与蛋白的磷酸化、G蛋白相互作用等信号转导事件有关,RhSep1可能存在复杂的蛋白水平调控机制。     

桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（BdorSer）的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer）,研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239 bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）丝氨酸蛋白酶（登录号XP_001352960）氨基酸序列的一致性最高,为65.8%。实时荧光定量PCR分析表明,BdorSer mRNA在桔小实蝇雌雄虫的不同组织中都有表达,且在触角中的表达量最高,分别是雌虫胸部的43.6和26.8倍。BdorSer mRNA在生殖节中表现出较大的性别差异表达特征,雄虫生殖节中的mRNA表达量是雌虫的18.25倍。BdorSer mRNA几乎在昆虫发育的各个时期都有表达,其中在卵及1,2,3龄幼虫中的表达量分别是10 d 蛹的 0.68,1.63,4.31和15.8倍。BdorSer mRNA随蛹的发育其表达量逐渐减低,1,4,7 d蛹中的表达量分别是10 d蛹的325,125和41倍。【结论】克隆获得了BdorSer,其表达的BdorSer蛋白可能在雄虫的生殖生理中发挥了作用,同时也可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其是1 d蛹的发育过程。     

家蚕丝氨酸蛋白酶BmHP14基因的克隆与表达模式分析

家蚕受到外源微生物侵染或损伤时,前酚氧化酶原级联反应中的起始丝氨酸蛋白酶会激活下游信号通路,最终产生黑色素。采用RACE技术,获得了家蚕前酚氧化酶原级联反应起始丝氨酸蛋白酶——血淋巴蛋白酶编码基因的全长cDNA序列,命名为BmHP14(GenBank登录号:JQ954757)。BmHP14 cDNA全长2 508 bp,开放阅读框为2 013 bp,编码670个氨基酸,预测蛋白质分子质量71 kD,等电点5.09,N端17个氨基酸预测为信号肽序列。多重序列比对显示BmHP14与烟草天蛾HP14的相似度很高,达到57%;分子进化树中二者也聚为一支。RT-PCR分析表明,BmHP14在家蚕5龄第3天幼虫脂肪体、马氏管、精巢、卵巢、表皮、血细胞、头部均有表达,其中以脂肪体中的表达水平最高。以黑胸败血芽孢杆菌、大肠杆菌、球孢白僵菌注射侵染家蚕5龄第3天幼虫,Real-time PCR检测显示在受到病菌侵染后,幼虫脂肪体中的BmHP14表达上调。Westernblotting检测结果显示,BmHP14在家蚕体液中以前体和成熟体的形式共同存在。研究结果提示,BmHP14是家蚕前酚氧化酶原级联反应信号通路中的关键酶。     

黄绿绿僵菌对马铃薯瓢虫体内脯活性的影响

对感染黄绿绿僵菌后的马铃薯瓢虫幼虫体内几种酶进行测定，结果表明：黄绿绿僵菌对于马铃薯瓢虫幼虫体内的蛋白质含量、蛋白酶、谷胱甘肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的活性，都有不同程度的影响，其中对蛋白含量和谷胱甘肽-S-转移酶的影响较大。