传染性造血器官坏死病毒糖蛋白抗血清的制备及应用

应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH 5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白.经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57 kDa.Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别.用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA显示抗体效价可达1∶64 000.经制备的抗血清可以作为一抗建立ELISA检测方法,用于检测细胞悬液的病毒粒子,将抗血清稀释到1∶16 000仍能与IHNV全病毒发生反应.本研究利用重组的IHNV糖蛋白成功制备了高效价的抗血清,并能够与IHNV全病毒发生特异性结合,为IHNV免疫学检测方法建立奠定了基础.     

埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基融合蛋白的真核表达与纯化

埃博拉病毒糖蛋白与病毒黏附、入侵宿主细胞等过程密切相关,为了更好地研究该糖蛋白与宿主细胞的相互作用,拟通过哺乳动物细胞表达系统,构建GP1亚基Fc标签融合蛋白。经鉴定,成功构建了埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达载体pFUSE-GP1-hIgG1-Fc2,并利用该载体及293T细胞构建了表达GP1亚基融合蛋白的哺乳动物细胞系。该融合蛋白N端带有IL2分泌信号肽,C端带有人IgG1-Fc2标签,可在293T细胞以分泌表达的方式存在于细胞培养上清中,而后利用Protein A亲和层析进行融合蛋白纯化。经Western Blots鉴定,成功制备GP1-Fc融合蛋白。这不仅为埃博拉病毒糖蛋白的研究提供了技术支撑,也为其他种类蛋白的哺乳动物细胞真核表达纯化提供了新思路。     

神秘果的变味奥秘

为什么"神秘果"具有独特的变味功能呢?多少年来,人们并不清楚其中的奥秘。1968年,日本科学家栗原坚三教授从神秘果中分离出一种"神秘果蛋白",正是由于该蛋白的生物活性,才导致了"神秘果"独特的变味功能。它的溶液能对舌头上的味蕾感受器发生作用。因此,有人把"神秘果蛋白"称为"变味素"。1989年,科学家首次对神秘果蛋白成功进行了测序工作,并发现     

大豆蛋白源饲料中添加Gln及其前体物对鲤Rh基因表达和血氨含量的影响

为研究植物蛋白饲料中添加谷氨酰胺(Gln)及其前体物对鲤鳃丝Rh糖蛋白基因表达水平和血氨含量的影响,本试验用6组试验料(以鱼粉为蛋白源的基础饲料,以豆粕全部替代基础饲料中的鱼粉的豆粕饲料,分别向豆粕饲料中添加Gln及其前体物鸟氨酸-α-酮戊二酸(OKG)、α-酮戊二酸(AKG)、谷氨酸(Glu)的四种添加剂饲料),饲喂鲤60d。结果表明:豆粕组Rh糖蛋白基因的表达量显著高于鱼粉组,但添加AKG、Glu、Gln后均能显著上调Rhag、Rhbg的表达,而OKG的添加对Rhbg、Rhcg1的表达影响不显著,但是对Rhag的表达却是下调作用。豆粕组的血氨含量显著高于鱼粉组,与豆粕组相比,添加4种添加物均降低血氨含量,说明4种添加物对摄食纯豆粕蛋白源饲料的鲤血氨含量具有很好的调节作用。     

扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

针对扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebolavirus,ZEBOV)的糖蛋白(GP)基因(158~368aa)设计引物,将PCR扩增产物克隆至原核表达载体pET30a(+),在宿主菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达。对诱导条件进行优化,纯化后的蛋白通过SDS-PAGE和Western blot鉴定正确后免疫BALB/c小鼠,二免后分离小鼠血清,制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,埃博拉病毒GP在大肠杆菌中以包涵体的形式成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导6h。经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体可以识别重组杆状病毒rBacmid-GP。本研究成功表达并纯化埃博拉病毒GP,制备鼠多克隆抗体,为建立基于ZEBOV GP的检测方法和相关研究奠定了基础。     

均质荧光复合微球技术定量检测狂犬病病毒中和抗体方法的建立

为实现对狂犬病病毒中和抗体的绝对定量检测,建立了检测中和抗体的均值荧光复合技术。用狂犬病毒糖蛋白标记带有荧光物质Eu3+的纳米微球载体,并用其特异性结合已捕获的中和抗体,根据荧光强弱判定抗体效价。通过试验我们获得了最佳反应条件;在此条件下,荧光强度与中和抗体效价具有良好的线性关系,相关系数能达到0.99以上;而且检测灵敏度能达到0.01IU/mL;另外此方法对犬温热病毒和犬细小病毒阳性血清不产生交叉反应,具有良好的特异性;并且与金标准FAVN的符合率达到98%。此方法不仅能够用于狂犬病毒中和抗体的特异性检测,而且能够实现绝对定量检测;在狂犬疫苗免疫效果评价和动物的检验检疫等应用中具有重要意义。     

Caco-2细胞模型及其P-gp转运功能研究

Caco-2细胞单层模型是研究药物吸收特性的重要工具,而P-糖蛋白(P-gp)对许多药物的药代动力学和药效学具有调控作用。对Caco-2细胞单层模型及P-gp功能进行研究,以便研究药物的体外转运机制。常规培养下,Caco-2细胞以2×105个/m L的密度接种400μL于Millicell培养皿中,通过观察细胞形态,绘制生长曲线,测定跨膜电阻值,检测细胞极性和罗丹明转运效率等对构建的细胞模型进行验证。结果:培养21 d后,细胞间形成紧密连接;跨膜电阻值达到恒定值,为(849±17)Ω·cm2;肠腔侧碱性磷酸酶活性显著高于基底侧酶活性,细胞形成极性分化,P-gp底物罗丹明在Caco-2单层细胞的表观通透系数(Papp)比值大于1.5(P(B→A)/P(A→B)1.5),加入P-gp抑制剂后P(B→A)/P(A→B)小于1.5。研究表明,构建的Caco-2细胞模型结构和生化作用与小肠上皮细胞相似,细胞模型具有完整性、紧密性,细胞发生极性分化形成肠绒毛结构,且P-gp功能良好,可作为研究药物体外转运的模型。     

中国鲤鱼春季病毒血症毒株糖蛋白基因的亚克隆表达与纯化

为了控制一类传染病-鲤鱼春季病毒血症(SVC),本文亚克隆了SVC中国株糖蛋白基因(SVCV-C1 G),并采用pET21a-SVCV-C1 G/BL21(DE3)表达系进行了表达。随后,纯化了SVCV-C1 G蛋白,纯化蛋白分子量为49.5 kDa。SVCV-C1 G蛋白由442个氨基酸组成,与其他弹状病毒糖蛋白的同源性在18.4%~99.0%。系统进化树显示,SVCV-C1 G属于Ia亚型。研究结果为进一步研制SVC基因工程疫苗奠定了基础。     

鸭肠炎病毒gC糖蛋白胞外区优势抗原表位的筛选与鉴定

为筛选出鸭肠炎病毒(DEV)gC糖蛋白胞外区的优势抗原表位,本试验通过抗原表位作图法对DEV-gC基因进行分段克隆并构建重组表达载体,表达蛋白经纯化后进行Western blot分析。结果显示,经过4轮筛选,DEV-gC糖蛋白优势抗原表位为第73-88位氨基酸。该优势表位的发现为DEV-gC糖蛋白具体功能区的研究、诊断试剂及表位疫苗的研制奠定了物质基础。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析

为了对流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白抗原表位E19进行核心序列定位,本研究设计了一系列编码相互部分重叠短肽核苷酸序列,原核融合表达后经western blot分析,确定其抗原表位核心序列为150ENHGNYS156.该表位在乙型脑炎不同基因型的各种病毒株间为高度保守序列;根据JEV E19表位与同一血清群其他黄病毒之间的差异,在同源序列位置设计了系列突变短肽,融合表达后western blot分析的结果表明,其他黄病毒属病毒同源序列不能与抗JEV阳性血清反应.本实验结果表明JEV E蛋白抗原表位E19具有鉴别检测JEV与西尼罗病毒等其它黄病毒的意义.本实验为进一步研究E蛋白结构和功能以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定了分子生物学基础.