吉林延边地区猪附红细胞体A1基因的克隆与原核表达

采用PCR方法扩增吉林延边地区猪附红细胞体A1基因片段,将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;分别构建A1重组pGEX-4T-1和PET-28-a表达质粒,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示:克隆的A1基因片段长1 044 bp,含有1个999 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸,与GenBank中A1基因序列(AM265536)的同源性为97%;表达的融合蛋白分子量分别为64 ku和40 ku,能被猪附红细胞体阳性血清识别。表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

猪支原体不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测猪支原体更为特异、敏感的PCR检测方法,本试验分别以16S rRNA、50S rRNA和膜蛋白OxaA为靶基因进行PCR检测,并从其敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以膜蛋白OxaA和16S rRNA为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为1.86 fg/μL,而以50S rRNA为靶基因的PCR方法最小检测DNA量为18.6 fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出大肠杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、牛附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;通过对临床60份血液样本的检测结果表明,以膜蛋白OxaA基因设计的引物检出率最高,为25%(15/60),明显高于16S rRNA基因的21.6%(13/60)和50S rRNA基因的18.3%(11/60)。本试验为猪支原体病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

羊泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求快速、有效检测羊泰勒虫的PCR方法,本试验建立了检测羊泰勒虫18SrRNA基因和表面蛋白基因的两种常规PCR方法和一种检测18SrRNA基因的半套式PCR方法,并从其敏感性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示:上述方法检测羊泰勒虫基因组DNA的最小检测量分别为1.6fg/μL、16fg/μL和0.016fg/μL;检测临床样本阳性检出率分别为31.37%(16/51)、17.64%(9/51)和45.10%(23/51)。3种方法中,检测18SrRNA基因的半套式PCR方法敏感性和临床样本检出率最高,其次为检测18SrRNA基因的常规PCR方法,最后为检测表面蛋白基因的常规PCR方法。结果说明,所建立的半套式PCR方法是一种较好的羊泰勒虫检测方法。     

牛瑟氏泰勒虫吉林株18S rRNA基因的扩增及系统发育研究

本研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,对寄生于牛体内的瑟氏泰勒虫基因组DNA进行扩增,得到1 356 bp的18S rRNA基因片段,测序后blast分析表明该虫种属牛瑟氏泰勒虫。将该基因片段序列与GenBank中8种已知泰勒虫的相应序列进行比较分析,建立系统发育树。结果表明,牛瑟氏泰勒虫吉林分离株与水牛泰勒虫亲缘关系最近,与小泰勒虫亲缘关系较远。这一结果说明宿主因素对泰勒虫的基因型影响较大。     

应用PCR方法调查东北三省部分地区猪附红细胞体病流行情况

为了解东北三省猪附红细胞体感染情况,应用血液压滴标本镜检法和PCR检测方法对东北三省部分地区600头份猪血液样本进行了检测。结果:血液压滴标本镜检法检测阳性率为87.3%(524/600),PCR检测方法检测阳性率为91.5%(549/600)。其中种母猪阳性率为87.2%(34/39),育肥猪阳性率为90.8%(347/382),断奶仔猪阳性率为92.9%(78/84),哺乳仔猪阳性率为94.7%(90/95);黑龙江省阳性率为93.5%(187/200),辽宁省阳性率为89.5%(179/200),吉林省阳性率为91.5%(183/200)。结果表明,东北三省猪附红细胞体感染情况严重。     

牛附红细胞体解离方法的比较

牛附红细胞体(E．wenyoni)一直被认为是致病性较弱的一种病原体，大多数呈亚临床感染。但近年来，牛附红细胞体病呈明显的蔓延趋势，尤其奶牛的感染情况严重，已给养牛业带来极大的经济损失。目前，对该病的病原生物学、免疫学研究还处于初级阶段。因此，建立一种较好的牛附红细胞体解离方法，可为牛附红细胞体病的病原学和免疫学等研究提供依据。     

驽巴贝虫BC-48基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法扩增驽巴贝虫吉林分离株BC-48基因片段，将扩增产砌与pGEM—TEasy载体连接，重组质粒经PCR、单酶切鉴定后测序；构建BC-48的重组pGEX-4T-2表达载体．经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE、Western—blotting分析。结果显示，克隆的BC-48基因片段长610bp，含有一个570bp的开放阅读框，编码189个氨基酸，与GenBank中USDA株（U46551）的同源性为96．7％；表达的融合蛋白为45ku，能被驽巴贝虫阳性血清识别；表明该融合蛋白具有较好的反应原性。     

猪附红细胞体小鼠感染模型建立条件的优化

为探究猪附红细胞体感染特性,进而优化猪附红细胞体小鼠感染模型建立的条件,本试验设计了不同小鼠处理方式感染试验（A试验）、不同病原形式感染试验（B试验）、冻存病原感染试验（C试验）和小鼠模型血液再感染小鼠试验（D试验）。通过对每个试验中各组小鼠血液感染情况、感染首现时间、临床症状和平均感染时间的综合评估,分析不同小鼠处理方式、不同病原形式、冻存病原及小鼠模型血液再感染是否对小鼠模型的建立有影响。通过PCR检测、电镜观察和特异基因片段序列测定,进一步鉴定小鼠模型感染的病原与猪附红细胞体是否一致。结果显示,A试验中,昆明小鼠切除脾脏组感染效果最优;B试验中,猪附红细胞体阳性血液样本组感染效果最优;C试验中,阳性血液未冻存组感染效果优于冻存组;D试验中,猪阳性血液样本组、小鼠模型阳性血液样本组无明显差异。PCR检测、电镜观察和特异基因片段序列测定结果显示,小鼠模型感染的病原与猪附红细胞体一致。结果表明,不同小鼠处理方式、不同病原形式和病原的冻存等条件对猪附红细胞体小鼠感染模型的感染效果均有影响,通过对比,以猪阳性血液感染切除脾脏的昆明小鼠的方式建立小鼠感染模型效果最优。     

弓形虫AMA1蛋白真核表达载体的构建及免疫活性检测

[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。