吉林省珲春地区羊泰勒虫病流行病学调查

为了解羊泰勒虫病在吉林省珲春地区流行情况,本试验应用PCR方法对珲春地区130份羊的血液样本进行了羊泰勒虫病的流行病学调查,并与血液涂片染色镜检法进行了比较。结果该地区羊泰勒虫病的PCR方法检测阳性率为29.23%,而血涂片染色镜检法的阳性率为15.38%。不同牧地,不同年龄和不同品种间的感染率则无显著差异。通过调查表明,吉林省珲春地区是羊泰勒虫病的流行地区。     

猪附红细胞体几种染色方法的比较

为了筛选出比较理想的染色方法,使猪附红细胞体病的诊断和研究得到可靠的技术保证,本试验对附红细胞体病猪的同一份血液样本,分别采用了12种染色方法进行染色,并比较其染色效果。结果显示,丫啶橙染色和姬-瑞氏混合液染色效果最好,其次为亚伯特氏、瑞氏和姬姆萨氏等染色方法。     

基于ENO基因的猪附红细胞体病 PCR-ELISA检测方法的建立

为建立猪附红细胞体病的PCR-ELISA检测方法,试验根据猪附红细胞体ENO基因序列,设计合成1对分别标记生物素(BIOT)和地高辛(DIG)的引物,进行PCR-ELISA检测。通过对包被液的种类和浓度、结合抗体的反应条件、封闭条件、PCR产物的稀释度及显色时间等条件进行优化,确定阴性、阳性判定的阈值,并进行特异性、敏感性及重复性验证。结果表明:该方法与猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫等均无交叉反应;敏感性比常规PCR高10倍,最低检出量为1.77×10~6拷贝/μL;对40份猪血液样品的,阳性检出率为22.5%。该试验建立的方法具有特异、敏感、安全等优点,将为猪附红细胞体病的临床诊断提供更准确、实用的检测方法。     

延边地区牛弓形虫感染情况的初步调查

为了解延边地区的牛弓形虫感染情况,试验采用间接ELISA方法对采自不同地方的318份血清样本进行了血清弓形虫Ig G抗体检测。结果显示:在318份血清样本中,检出34份阳性血清,血清弓形虫抗体总阳性率为10.69%,不同地方阳性率之间存在统计学差异。本次调查首次证实了延边地区牛存在弓形虫感染,这对人畜已造成潜在的危害,应该引起相关部门的高度重视。     

犬新孢子虫NcSRS2基因片段的克隆及原核表达

以含有犬新孢子虫NcSRS2基因的质粒pMD18-NcSRS2为模板,应用PCR方法扩增Nc-SRS2基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,构建了重组表达质粒pGEX-Nc-SRS2,转化大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的基因片段长1100bp,SDS-PAGE、Western blotting分析显示,重组质粒pGEX-NcSRS2在大肠杆菌中得到了高效表达。     

牛附紅细胞体解离方法的比较

为建立一种较好的牛附红细胞体解离方法,我们对同一感染附红细胞体牛的血液样本,应用三种方法对牛附红细胞体进行了解离。通过显微镜检查及测定蛋白质浓度比较其解离效果。结果表明,体外培养解离法效果最好,化学试剂法次之,而水浴法解离下的牛附红细胞体数量最少,但附红细胞体的运动性较强。本试验为进一步研究牛附红细胞体的生物学特性及抗原分析奠定了基础。     

吉林株犬新孢子虫SAG1基因片段的克隆及蛋白抗原性预测

[目的]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆与序列分析。[方法]从细胞培养的吉林株虫体中提取犬新孢子虫DNA,根据已发表的犬新孢子虫鲥G1基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,采用PCR技术,扩增大新孢子虫SAG1基因片段,并成功克隆到pMD18-T simple载体上,对经PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列分析。[结果]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆后,获得阳性重组质粒。克隆的SAG1基因片段长780bp,编码260个氨基酸,与已发表的美国株犬新孢子虫SAG1基因核苷酸序列（AF132217）的同源性为99．0％,氨基酸序列同源性为98．8％。通过分子生物学软件对翻译水平进行预测,发现吉林株核苷酸序列并不影响氨基酸翻译与蛋白质的表达。[结论]该试验成功克隆重组质粒,为建立犬新孢子虫的高效表达系统奠定了基础。     

VP22与EGFP、3种弓形虫抗原融合表达重组质粒的构建与鉴定

为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽VP22与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-EGFP）,以及细胞渗透肽VP22与3种弓形虫抗原融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-SAG1、pcDNA-VP22-GRA4、pcDNA-VP22-AMA1）。经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定后,将重组质粒pcDNA-VP22-EGFP转染COS7细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR检测,验证VP22-EGFP基因在COS7细胞中的表达情况。PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定结果显示所有重组质粒均构建正确。转染72 h后的细胞,在荧光显微镜下成功观察到绿色荧光。RT-PCR扩增得到了大小为1 449 bp的目的条带,与预期结果一致。结果表明,重组质粒构建成功。     

牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法的建立

本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。