猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法的建立

实验通过纯化猪附红细胞体后免疫小鼠及家兔制备阳性血清,建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法.实验结果表明,以鼠阳性血清1:200稀释后作为捕获抗体,4℃包被过夜,1%明胶溶液37℃封闭1 h,兔阳性血清1:400稀释后作为检测抗体,辣根过氧化物酶标羊抗兔Igc抗体h:8000稀释,37℃显色10min为最佳反应条件.同时进行特异性、敏感性、重复性实验.该方法对猪附红细胞体最低检出量为3.812μg·mL-1,具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望作为群体检测方法.     

猪附红细胞体特异性PCR检测方法的建立

从猪血中分离附红细胞体,提取其基因组DNA,用EcoRI对基因组DNA进行酶切,将酶切片段进行琼脂糖电泳,得到一个1.8 kb的DNA片段,根据DNA序列分析与GenBank已知基因比较和PCR方法确定该片段具有特异性,以该片段为模板进行PCR,并将其扩增产物与其它猪的其他细菌DNA扩增产物相比较,建立一种检测猪外周血中附红细胞体的特异性PCR检测方法,并通过斑点杂交试验检测该产物特异性,通过临床应用检验该法的适用性。结果表明:扩增产物大小为782 bp,其序列与已知附红细胞体序列同源性为100%,斑点杂交试验证实该产物为附红细胞体特异性产物,将该方法应用于检测10头临床症状典型的感染猪和10头健康猪的血液,所有感染和隐性带菌猪的PCR检测结果为阳性,健康猪为阴性。猪外周血中附红细胞体的特异性PCR检测方法适用于检测无临床症状的隐性带菌动物。     

羊附红细胞体巢式PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种更加准确、敏感的羊附红细胞体检测方法,根据Gen Bank上发表的羊附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号:AF338268),设计内、外2对特异性引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性、重复性试验及临床样本检测。结果表明,该方法能扩增出大小为506 bp的羊附红细胞体特异性片段,与Gen Bank收录的相关参考序列同源性为97.8%~99.6%;与猪附红细胞体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊无浆体、莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为0.654 fg·μL~(-1);具有良好的重复性;对77份羊临床血液样品检测结果表明,羊附红细胞体感染率为71.43%,高于常规PCR和已报道的巢式PCR检测结果。     

猪附红细胞体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建一种快速、高效、灵敏的猪附红细胞体(M.suis)检测方法。本研究根据GenBank中的猪附红细胞体α-烯醇化酶(Eno)基因(序列号:AB265823.1),设计并合成了1对引物P5和P6,通过常规PCR方法对Eno基因中的一段序列进行扩增,并将其纯化后的PCR产物克隆入pMD-18T载体中,从而构建重组质粒。以阳性重组质粒为模板,建立了猪附红细胞体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对其灵敏性、特异性进行检测。在1.44×10~6~1.44×10~2拷贝/μL范围内具有较好的线性关系,相关系数R~2=0.965,检测到的浓度下限为1.44拷贝/μL。特异性试验中仅对猪附红细胞体的检测结果呈阳性,而对猪肺炎支原体、弓形虫、猪链球菌、猪呼吸与繁殖综合征病毒的检测结果均呈阴性。重复性试验结果表明,其组内和组间变异系数均小于2.0%。用该检测方法对49份猪附红细胞体疑似血液样品进行检测,所建立的荧光定量PCR方法检测的阳性率为40.8%(20/49),高出常规PCR方法检测的阳性率1.33倍。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的成功建立,为猪附红细胞体感染的早期诊断及定量分析提供了可靠依据。     

猪附红细胞体PCR诊断方法的建立

据猪附红细胞体重庆株16S rRNA基因的序列特点设计合成种特异性引物,建立了猪附红细胞体PCR诊断方法.该方法能特异性扩增840 bp的猪附红细胞体16S rRNA基因片段,而对牛温氏附红细胞体、羊附红细胞体、猫血巴尔通氏体CA株、绵羊肺炎支原体、猪肺炎支原体、假单孢茵、大肠杆茵、沙门氏茵、肝片吸虫、葡萄球菌等的基因组DNA没有扩增条带出现.对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为0.16 fg.通过对30份临床样品的检测,21份猪附红细胞体感染为阳性,其余为阴性.结果表明:建立的PCR诊断方法具有很高的敏感性和特异性,可用于猪附红细胞体的临床诊断和流行病学调查.     

猪附红细胞体感染SD大鼠模型的建立和免疫学指标的研究

[目的]建立SD大鼠人工感染猪附红细胞体病动物模型,并检测相关的免疫学指标。[方法]用猪附红细胞体阳性血样,腹腔注射SD大鼠,通过光镜检测和PCR鉴定动物模型的成功建立,并对SD大鼠进行红细胞免疫功能测定、T淋巴细胞百分率检测及淋转试验的检测。[结果]SD大鼠感染猪附红细胞体后CD35明显升高,BBC-C3b和RBC-IC花环率明显降低,外周血ANAT＋T淋巴细胞百分率显著降低,淋巴细胞的转化功能差异不明显。[结论]猪附红细胞体人工感染SD大鼠动物模型成功建立,并可引起SD大鼠红细胞免疫功能下降。     

温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及其应用

为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178 fg。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。     

羊附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用

根据羊附红细胞体16S rRNA基因序列设计特异性引物,建立了羊附红细胞体的PCR诊断方法.该方法能扩增羊附红细胞体16S rRNA基因片段,对大肠杆菌、羊无形体、羊源支原体、猪附红体和假单孢菌基因组DNA没有扩增出条带,所能检测羊附红细胞体DNA的最低量为1.82 pg/mL.运用所建立的方法对从重庆市荣昌县采集的110份羊血样进行附红细胞体检测,其中13份羊附红体感染阳性,表明该方法特异性和灵敏度高,可用于急性羊附红细胞体病和临床带菌羊的检测.     

空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法的建立

针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)旋转酶基因(gyrA gene)设计特异性引物和探针,将生物素和地高辛分别标记上游引物5＇端和核酸探针3 ＇端,并对反应条件进行优化,建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法.结果表明:该方法能特异的检测空肠弯曲杆菌基因组DNA,检测阈值为2fg,敏感性是常规PCR的10倍.对模拟泄殖腔样本进行检测,检测限为50 cfu/mL.对100份临床样品进行检测,PCR和PCR-ELISA方法阳性检出率分别为60％和69％.     

肉牛附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一个能快速准确的检测出肉牛附红细胞体的分子生物学诊断方法,及时监控好人畜共患病。试验根据Genbank中发表的肉牛附红细胞体16SrRNA序列设计一对特异性引物,通过PCR方法,对肉牛附红细胞体基因组DNA进行扩增。结果表明:扩增出了一段412 bp的DNA片段,与Genbank中发表的肉牛附红细胞体序列同源性为98%。将建立的PCR方法对大肠杆菌、弓形体、胸膜肺炎放线杆菌的DNA进行检测为阴性,检测肉牛附红细胞体DNA的最低浓度为1.23 ng/μL。该方法快速、准确、特异性好、灵敏度高,为肉牛附红细胞体病的临床诊断提供了新的方法。     

应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA检测方法的建立

 【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白（rMSG1）和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测,并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测手段。【方法】将MSG1-pET28c_E.coli BL21菌株,在适宜的条件进行诱导表达,经菌体破碎、层析等步骤获取纯化的目的蛋白。以纯化的rMSG1制备免疫原接种小鼠,获取符合要求的多克隆抗体。以rMSG1和多克隆抗体建立ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、符合性和重复性。【结果】接种后获得了符合效价的抗血清;基于rMSG1的间接ELISA方法临床检测猪附红细胞体感染率为46.25%,其中阳性样本对已知小鼠抗血清有明显的阻断作用,并且与其它一些抗原无交叉反应;此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97.06%和95.92%,较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率。【结论】结果显示MSG1具有良好的抗原性,建立的ELISA方法具有较高的敏感性、特异性、符合性和可重复性,在临床检测中可以取得理想的效果。     

4种药物对猪附红细胞体病疗效的观察

试验旨在观察4种药物对猪附红细胞体病的治疗效果,为猪附红细胞体病的治疗提供最佳治疗方案。将40～60日龄患附红细胞体病猪15头随机分成5组,试验Ⅰ组：血虫净;试验Ⅱ组：长效土霉素;试验Ⅲ组：硫酸卡那霉素;试验Ⅳ组：血虫净＋长效土霉素;对照组。对病猪进行治疗,分别在用药后1d、2d、3d、4d、5d、6d耳静脉取血,检测血液中红细胞的感染强度,以检测不到附红细胞体为有效。结果显示：试验Ⅰ组在第4d检测不出附红细胞体;试验Ⅱ纽在第6d检测不出附红细胞体;试验Ⅲ组在第6d检测红细胞感染强度为“＋”;试验IV纽第3d检测不出附红细胞体;对照组无变化。由此可见,血虫净、长效土霉素、硫酸卡那霉素对猪附红细胞体病均有效,但以血虫净＋长效土霉素治疗效果最佳。     

猪圆环病毒与猪附红细胞体混合感染的诊断与防治

[目的]探索猪圆环病毒与猪附红细胞体混合感染的诊断方法与防制措施。[方法]分别从发病情况、临床症状、病理解剖、诊断防制措施等方面对猪圆环病毒与猪附红细胞体混合感染进行介绍。[结果]猪圆环病毒与猪附红细胞体混合感染可引起断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS);其病征为体温高、贫血、黄疸、精神沉郁,消瘦、发育障碍,同时出现贫血、黄疸、发热等症状;诊断方法有血液压片镜检、血清学检测、猪圆环病毒(PCV)的PCR检测等;防制措施有加强饲养管理、防止继发感染、综合防治、对症治疗等。[结论]该研究为养猪业可能发生的猪圆环病毒与猪附红细胞体混合感染提供了防治方法。     

安徽省泗县猪附红细胞体病流行病学调查

[目的]对安徽省泗县猪附红细胞体病进行流行病学调查。[方法]从泗县3个乡镇收集300份疑似病例血样,对其进行血液涂片检查、PCR检测和基因测序。[结果]不同规模或饲养方式的猪场猪附红细胞体感染情况不同。从调查地点来看,墩集镇猪场感染率最高,达65%;其次是黄圩镇,感染率为44%;大庄镇猪场猪附细细胞体感染率最低,为39%。仔猪感染率低于育肥猪,育肥猪感染率为54.67%,仔猪感染率仅44.00%。[结论]安徽省泗县猪附红细胞体病感染率较高,应加强预防和控制。     

猪附红细胞体特异性基因的克隆和序列分析

为分析吉林省流行的猪附红细胞体基因序列,根据发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计引物,扩增出长度约为541 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆到pGEM-T Easy载体.将经Not Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,与发表的附红细胞体基因序列进行比较,试验所获得的核苷酸序列与猪附红细胞体16S rRNA基因序列非常相近,同源性为97.8%～100%,从而证明吉林省所流行的猪附红细胞体属于16S rRNA基因群.     

猪附红细胞体快速诊断方法的研究

根据GenBank上已报道的猪附红细胞体16S rRNA的序列设计一对特异性引物,进行PCR扩增并将产物克隆到T-vector后测序.结果表明扩增到的目的基因片段为404 bp,与GenBank上Mycoplasma suis序列同源性为97%.试验建立的PCR诊断方法特异性强,与健康猪血液、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、弓形虫、猪圆环病毒DNA无交叉反应,能检测出的最低DNA浓度是8.6 fg·μL-1.该方法具有快速、准确、敏感等特点,为浙江地区猪附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段.     

猪附红细胞体病家兔感染模型的免疫指标检测

[目的]观察家兔人工感染猪附红细胞体后的免疫指标的变化。[方法]采用猪附红细胞体阳性血样,以腹腔注射的方式人工感染家兔。模型建立后,通过血液压片镜检及PCR方法检测。感染家兔进行红细胞免疫功能的测定、T淋巴细胞百分率检测,并利用淋转实验等对家兔感染后的免疫指标进行监测。[结果]家兔感染附红细胞体后,RBC-C3b和RBC-IC花环率明显下降,外周血ANA;E+T淋巴细胞百分率显著降低,淋巴细胞的转化功能差异不明显。[结论]猪附红细胞体人工感染家兔后可引起家兔的细胞免疫,造成红细胞免疫功能下降。     

半套式PCR方法检测猪附红细胞体病的建立

建立一种客观敏感的附红细胞体病早期实验室诊断方法。本实验采用已公布的附红细胞体序列设计半套式引物进行PCR扩增,对扩增出得特异性条带进行序列分析。镜检结果阳性率为75%,PCR检测结果阳性率为90%,测序结果与已公布的序列同源性达99.9%。半套式PCR方法比镜检高效准确,适合附红细胞体病的早期诊断。     

猪附红细胞体PCR检测方法的建立

 根据已发表的部分猪附红细胞体序列设计了一对特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出了一条约936 bp的基因片段，并成功地将该基因克隆于克隆载体PMD18-T，经酶切分析和PCR进一步鉴定后进行序列测定，结果表明，所克隆的目的基因与GenBank中发表的序列一致。并利用特异性引物初步建立了猪附红细胞体病PCR检测技术。     

瑟氏泰勒虫血液直接PCR检测方法的应用

为建立快速、灵敏、特异、低成本的瑟氏泰勒虫检测方法,根据GenBank上发表的瑟氏泰勒虫p33基因序列设计合成1对引物,通过PCR退火温度的筛选、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立瑟氏泰勒虫血液直接PCR检测方法。该方法能扩增瑟氏泰勒虫p33基因的1段416 bp序列,而与弓形虫、新孢子虫、牛附红细胞体基因序列均无交叉反应。该方法检测出的1μL血液最大稀释倍数为40。应用血液直接PCR方法和常规PCR对吉林省8个地区某牛场采取的210份样本进行检测的结果表明:直接PCR阳性率为30.0%,而常规PCR阳性率为25.7%,差异不显著(P0.05);两者的总符合率为94%,阳性符合率为80%,阴性符合率为92%;2种方法之间的Kappa值为0.85,说明该法更具有推广和应用价值。该试验成功应用了血液直接PCR检测方法,为瑟氏泰勒虫病的快速诊断和流行病学调查提供了一种新的方法。