螺杆菌属LAMP快速检测方法的研究

螺杆菌与人和动物多种疾病发生的相关性一直是国内外研究的热点之一,而各类螺杆菌感染日益引起人们的关注。为建立一种螺杆菌属通用的LAMP快速检测方法,根据螺杆菌属16S rRNA基因序列保守区域设计一组特异性引物,进行条件优化、特异性和敏感性试验。结果表明:在65℃反应60 min的条件下建立的螺杆菌属LAMP扩增反应最佳,并呈良好特异性,未检测到其他常见细菌。灵敏度达3 pg·μL~(-1),与PCR结果无差异,但操作上更易于完成。该方法快速、准确、灵敏,可用于螺杆菌的快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究进展(综述)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是能够引起母猪的繁殖障碍和新生仔猪呼吸症状的一种严重危害养猪业的传染病。20世纪90年代以来，此病已几乎传播到世界各养猪国家，造成世界养猪业严重经济损失。此病在中国的流行和分布也日益广泛，危害也日益严重，故受到国内外学者的高度重视，对本病的研究也正在逐渐深入。特别是诊断和检测技术的研究正日益受到关注，并建立起了一些新的方法和技术，如RT-PCR、阻断ELISA、原位杂交(ISH)等，同时，一些传统的诊断检测技术也得到了改进。这都为PRRSV的诊断和检测提供了新的思路和方法。     

猴轮状病毒(SA11)RT-PCR检测方法的建立

根据具有高度保守性的编码VP7轮状病毒糖蛋白的基因9序列设计引物，分别进行RT-PCR和NT-PCR扩增。结果：引物Beg9／End9、Beg9-1／End9-1及引物RVG9／aET3、RVG9／aET3-1分别能在一次RT-PCR扩增中出现预期的1062bp和374bp扩增带；引物RvGg／aET3、RVG9／aET3-1在NT-PCR扩增中均能出现预期的374bp扩增带；验证了猴轮状病毒SA11属于血清型3；引物RVG9／aET3进行敏感试验能检测到0．5pg的轮状病毒(SA11)dsDNA。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒间接ELISA方法的建立

采用Ⅰ型鸭肝炎病毒通过SPF鸡胚进行病毒培养和增殖,反复冻融后离心-0.22μm滤膜过滤-差速离心-蔗糖密度梯度离心法纯化后作为ELISA包被抗原,建立了鸭病毒性肝炎-Ⅰ型病毒全病毒间接ELISA诊断方法。试验表明:此方法具有敏感性高、特异性好的优点,为快速诊断鸭病毒性肝炎-Ⅰ型病毒感染提供了一条方便的途径。     

上海地区猴免疫缺陷病毒和猴D型逆转录病毒感染的血清学调查

为了解上海地区实验用猴感染猴免疫缺陷病毒(SIV)和猴D型逆转录病毒(SRV)的情况,用间接ELISA方法对2012—2015年上海各实验用猴生产单位送检的475份猴血清进行了检测。结果显示SIV抗体阳性血清20份,阳性率4.21%;SRV抗体阳性血清1份,阳性率0.21%,阳性率与送检年份和无相关性。本研究为上海地区实验用猴SIV和SRV的预防提供参考依据。     

3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法.根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验.结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368 bp.最佳退火温度在56~59 ℃之间,引物浓度均为0.2 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Mg²⁺浓度为2.5 mmol/L.3种细菌间无交叉反应.对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应.最低能同时检测到10^-5 ng/μL的细菌基因组DNA.3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好.同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出.结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持.     

RT-PCR检测实验小鼠自然和实验感染鼠诺如病毒

为了解小鼠自然感染鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的情况,采集80只实验小鼠的粪便样本,应用RT-PCR方法扩增粪便样本的MNV ORF2特异性基因(187 bp,MNVnt 5473-5659)片段.对PCR检测为阳性的粪便样本经10倍体积的PBS稀释后灌胃到4只ICR小鼠体内,1周后,将3只ICR小鼠与灌胃的小鼠同居饲养,观察小鼠是否出现异常症状,定期采集粪便做RT-PCR检测,研究小鼠实验感染MNV的情况.1个月后,处死小鼠,采集粪便、盲肠、十二指肠、脾、肝、大脑、肾、肺、心脏、胸腺、子宫、卵巢和唾液腺等器官做RT-PCR检测,研究MNV的主要感染部位.结果表明,自然感染的阳性率为13.75％(11/80);实验感染的小鼠外表健康、活泼、没有腹泻现象,阳性率为100％;主要的感染部位为小鼠的消化系统.本研究是首次在上海地区实验小鼠粪便中检测到MNV.     

猪副粘病毒感染的初步诊断和病毒分离

在临床症状复杂的不同猪群中 ,分离出 4株副粘病毒。该病毒能凝集鸡红细胞 ,其血凝性能被鸡新城疫标准血清抑制。病毒能在鸡胚中生长繁殖。电镜观察不是冠状病毒而是副粘病毒。该病毒能引起猪的腹泻、呼吸急促、繁殖障碍、神经症状和体温升高等临床症状。     

2株不同来源的新城疫病毒的F基因克隆和序列分析

以1株从发病鸽中分离到的新城疫病毒(PNDV／99株)和1株从发病鹅中分离到的新城疫病毒(GNDV／00株)为研究对象，用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)对它们的F基因进行分段扩增、定向克隆到pUCll9质粒载体，然后测定它们的核苷酸序列，并推导出相应的氨基到序列。PNDV／99株和GNDV／00株的F基因全长1662bp，编码553个氨基酸，它们的裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，是NDV弱毒株特有的序列结构。序列分析结果表明，它们2株之间的核苷酸同源率高达99．28％，氨基酸同源率则为100％；它们与国内标准毒株F48E9的核苷酸同源率只有87．48％和87．36％，氨基酸的同源率都为91．68％；而它们与弱毒株La Sota的核苷酸同源率别为98．50％和98．74％，氨基酸同源率都为98．73％。     

实验小鼠感染小鼠肝炎病毒后的抗体变化

采用MHV-A59标准毒株通过3种途径(腹腔、滴鼻、灌胃)对6个品系的实验小鼠(BALB/c、C57、nu/nu、NIH-Ⅲ、IL-4T、IL-10T)进行了病毒感染。通过检测小鼠感染后1个月内不同时段的抗体变化,发现小鼠在感染MHV后,血清转阳一般发生在感染后5-7 d,3周左右特异性IgG水平达到高峰;而特异性IgM水平出现上升时间比IgG早,3 d左右开始升高,7 d到达高峰,3周后开始下降。不同品系小鼠由于遗传背景不同,对MHV的易感性和耐受性存在明显差异。不同感染途径之间也存在着一定的差异,腹腔感染MHV的小鼠抗体转阳时间和IgG、IgM高峰水平出现的时间都较滴鼻和灌胃途径早,而滴鼻感染MHV后小鼠抗体转阳时间出现较晚,但其维持时间较长,认为MHV感染后产生免疫力的持久性在很大程度上取决于免疫途径的选择。