陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906bp处为同义突变,110和278bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。     

广西巴马小型猪SLA-DQB 基因 的克隆及序列分析

利用RT-PCR 的方法从广西巴马小型猪肝脏组织中扩增SLA-DQB 基因的编码区序列,旨在为下一步构 建SLA-DQB 转基因广西巴马小型猪奠定基础。结果表明,克隆的广西巴马小型猪SLA-DQB 基因编码区长687 bp,与 GenBank 参考序列（NM_001113694）相比,共有15 个氨基酸发生突变（位点为10、14、19、27、29、38、39、48、58、61、68、 72、76、78、183）。与普通猪、其他小型猪、奶牛、人类及小鼠的同源性分别为95.8%、95.8%、88.1%、86.2%和80.0%。     

发酵豆粕替代鱼粉在水产养殖业的应用北大核心

替代鱼粉的蛋白资源开发成为近年来水产养殖业营养研究的热点。其中,发酵豆粕以其较高的蛋白质含量、平衡的氨基酸组成并含有较低的抗营养因子等特点受到关注。综述发酵豆粕及其营养特点、发酵豆粕替代鱼粉在水产养殖业的应用及其使用存在的问题,为后续研究及生产实践提供参考。     

3个不同群体罗氏沼虾线粒体16SrRNA基因序列分析及遗传差异

利用PCR技术扩增获得罗氏沼虾线粒体16SrRNA基因的部分片段,通过序列测定和用限制性内切酶MboI、AluI和TaqI分别对上述PCR产物进行限制性片段长度多态分析(RFLP),分析了取自缅甸引进种子代、广西养殖群体及江苏养殖群体3个不同群体罗氏沼虾的遗传差异。结果表明:在3个群体间序列同源性对比无变异,PCR-RFLP未发现有片段多态性,3个群体间不存在遗传结构差异。可能表明这3个群体的罗氏沼虾起源同一个种群,且分化较低。     

广西三黄鸡脂蛋白脂酶基因的克隆及蛋白构象分析

【目的】对广西三黄鸡和爱拔益加（AA）鸡的脂蛋白脂酶基因（LPL）进行克隆与蛋白质结构分析,为后期开展LPL基因表达与鸡肌内脂肪含量相关性研究及筛选出与优质肉质相关的分子遗传标记奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡LPL基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因cDNA序列,经双酶切鉴定和序列测定比对分析后,应用生物软件进行蛋白质二级结构预测分析。【结果】成功获得广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因编码区序列（CDs）,大小均为1473 bp,两者的同源性为99.4%;将广西三黄鸡LPL基因序列提交至GenBank获得序列号JX090309。相对于AA鸡,广西三黄鸡LPL基因CDs存在9个位点的碱基突变,其中碱基503T→C导致氨基酸168Val→Ala,606T→G导致202Asp→Glu,1066A→G导致356Thr→Ala,1277C→T导致426Ser→Phe,1420A→G导致474Arp→Gly,1432G→A导致202Glu→Lys,这6个位点为错义突变;第166、372和1305位点的碱基突变为同义突变。蛋白质二级结构预测结果表明,广西三黄鸡与AA鸡LPL的C端结构域存在空间构象差异。【结论】LPL基因突变引起的氨基酸组成变化及蛋白质二级构象改变,可能影响鸡肌内脂肪沉积,进而决定肉质的优劣,即LPL基因可作为研究广西三黄鸡肌内脂肪代谢的主要候选基因。     

广西巴马小型猪MyoG基因克隆及外显子3多态性分析

为了解RT-PCR扩增广西巴马小型猪肌细胞生成素(MyoG)cDNA序列,并分析与其他物种间的聚类关系,试验采用PCR-SSCP技术分析广西巴马小型猪、长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因外显子3多态性,根据GenBank中已发表的猪MyoG基因序列设计PCR引物,以广西巴马小型猪肌肉组织总RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;从4个猪种的耳组织中分别提取30个个体的基因组DNA,采用PCR的方法扩增出外显子3并进行SSCP分析。结果表明:克隆得到广西巴马小型猪MyoG基因编码区长675 bp,与四川野猪、人、奶牛、小鼠同源序列相似性分别为99.7%、93.8%、91.7%、90.5%,且不同物种间保守性较强;与四川野猪相比,克隆得到的广西巴马小型猪MyoG cDNA序列在第233位点及第642位点上发生基因突变;广西巴马小型猪MyoG基因的基因型只有AA型,而长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因的基因型只有AB型,各群体内无多态性。     

广西巴马小型猪氟烷基因PCR-RFLP分析

采用PCR-RFLP分析了广西巴马小型猪的氟烷基因类型.结果显示,PCR扩增获得广西巴马小型猪氟烷基因片段长452 bp,其碱基序列与GenBank公布的普通猪同源性为99.6％;采用Hha Ⅰ酶切检测广西巴马小型猪、巴长二元杂猪和长白猪氟烷基因的PCR产物,均产生2条电泳条带,未表现多态性;测序表明广西巴马小型猪氟烷基因第1 843位碱基均为C.猪氟烷基因PCR-RFLP分析技术为优质猪的培育提供了理论依据.     

4个品种猪血清中sLAIR-1表达量的ELISA检测

【目的】进一步证实利用广西巴马小型猪建立异种器官移植供体模型的可行性。【方法】利用夹心ELISA方法分别检测广西巴马小型猪、长白猪、大约克猪及杜洛克猪血清中可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1（sLAIR-1）含量,筛选出血清中sLAIR-1表达量最低的猪品种,为异种移植提供一定参考指标。【结果】所检测的4个不同品种猪血清中sLAIR-1的表达量分别为：广西巴马小型猪(2.39±0.20 μmol/L)＜大约克猪(3.51±0.28 μmol/L)＜长白猪(3.59±0.28 μmol/L)＜杜洛克猪(3.62±0.31 μmol/L),且广西巴马小型猪血清中sLAIR-1的表达量显著低于长白猪、大约克猪、杜洛克猪3个品种(P＜0.01)。【结论】广西巴马小型猪在异种移植中具有良好的先天优势,可能会成为异种移植的理想动物模型。     

广西三黄鸡PPARγ谨因克隆及实时荧光定量PCR的建立

【目的】克隆广西三黄鸡过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因,建立该基因的实时荧光定量PCR,为后续开展广西三黄鸡PPARγ基因组织表达谱及品种间表达差异研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡PPARγ基因序列保守区域,用Oligo6．0软件设计合成1对引物,以广西三黄鸡脂肪总RNA为模板,用RT-PCR从广西三黄鸡克隆PPARγ基因。以携带PPARγ基因片段的重组质粒为标准品,建立基于SYBR GreenⅠ染料法的实时荧光定量PCR标准曲线。【结果】广西三黄鸡PPARγ基因的编码区序列（CDS）长1428bp,编码475个氨基酸;与GenBank已公布的鸡PPARγ基因（AF163811）参考序列比对,其同源性为99．7％,存在4个位点碱基突变,但均为无义突变。广西三黄鸡PPARγ基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程为：y=-3．568x＋28．50,扩增效率为1．907,实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线峰单一。【结论】鸡PPARγ基因在进化中比较保守;建立的广西三黄鸡PPARγ基因实时荧光定量PCR是可行的。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。