努比亚山羊LMCD1基因生物信息学分析、真核表达载体的构建及表达

【目的】 扩增努比亚山羊LIM结构域基因1（LIM domain gene 1,LMCD1）并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测LMCD1基因的表达情况,为研究努比亚山羊LMCD1基因功能及探究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的作用提供依据。【方法】 从努比亚山羊背最长肌组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增LMCD1基因CDS区序列,并进行生物信息学分析;将LMCD1基因以同源重组的方式连接pEGFP-N1载体,经酶切、测序鉴定后重组阳性质粒命名为pEGFP-N1-LMCD1;将pEGFP-N1-LMCD1重组质粒转染至山羊骨骼肌卫星细胞,通过实时荧光定量PCR检测努比亚山羊LMCD1基因的表达情况。【结果】 努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列全长1 092 bp,编码363个氨基酸。LMCD1蛋白分子式为C₁₇₇₅H₂₈₁₈N₅₀₈O₅₃₃S₂₉,分子质量为40.73 ku。努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列与山羊相似性最高（99.8%）,与斑马鱼相似性最低（55.4%）,与其他物种的相似性在87.0%~98.8%之间。LMCD1蛋白无信号肽,不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。通过构建努比亚山羊pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体并转染至骨骼肌卫星细胞,过表达LMCD1基因,产生绿色荧光信号。【结论】 试验成功扩增LMCD1基因CDS区序列,构建了pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体,并分析了生物学功能,为后续开展LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的机制研究提供了理论基础。     

陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906bp处为同义突变,110和278bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。     

广西巴马小型猪PPARγ基因克隆及组织表达差异分析

[目的]克隆广西巴马小型猪过氧化物酶增殖物激活受体γ基因(PPARγ),并确定其在不同组织中的表达情况,为后续研究该基因在猪支原体肺炎(MPS)中的作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR克隆广西巴马小型猪PPARγ基因,并进行BLAST比对分析及其推导蛋白的生物信息学分析;以实时荧光定量PCR检测PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪心脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉和脂肪中的表达情况.[结果]广西巴马小型猪PPARγ基因开放阅读框序列1515 bp,编码504个氨基酸.广西巴马小型猪PPARγ基因推导氨基酸序列与GenBank已发表的猪PPARγ基因(FJ436399.1)推导氨基酸序列同源性最高,达100.0%;而与牛(NM_181024.2)、人类(NM_005037.5)、猕猴(NM_001032860.1)、鼠(NM_001308354.1)和鸿雁(KJ019822.1)的同源性分别为92.9%、91.8%、91.5%、90.5%和83.5%,表明PPARγ基因高度保守.PPARγ蛋白分子量为57380.91 Da,理论等电点(pI)为6.88,不稳定系数49.26,脂肪指数为88.21,亲水性平均水平为-0.293,为亲水性蛋白,其二级结构主要是α-螺旋,占总数的39.09%.PPARγ基因在广西巴马小型猪大肠组织中的表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),而在肾脏、心脏和肌肉组织中的表达量极低.[结论]PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪的各组织中均有表达,但不同组织中的表达水平存在明显差异,可能与其在不同组织中的功能差异有关.     

努比亚山羊脂肪和肥胖相关蛋白基因克隆分析及真核表达载体构建

研究旨在对努比亚山羊脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesityassociated protein,FTO）基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。取努比亚山羊背最长肌组织作为试验材料,采用RT-PCR扩增出FTO基因的编码区,测序鉴定后对得到的序列用相应的分析软件进行生物信息学分析,然后将FTO基因片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建pMD19-T-FTO载体,测序正确的重组质粒双酶切后,连接pEGFP-N1载体构建pEGFP-N1-FTO真核表达载体,然后转染3T3-L1细胞,培养48 h后,在荧光显微镜下观察细胞表达荧光的情况。结果表明,试验成功克隆了努比亚山羊FTO基因的编码区,序列长度为1 518 bp,编码505个氨基酸,分子质量为57 142.24 u。努比亚山羊FTO基因编码区序列与NCBI上公布的山羊、牛、绵羊、猪、原鸡、小鼠的相似性分别为98.7%、96.4%、98.3%、87.2%、64.3%、81.7%,该基因系统进化树分析显示,努比亚山羊与山羊遗传距离最近,与原鸡遗传距离最远,在不同物种中具有高度保守性。努比亚山羊FTO蛋白二级和三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建的真核表达载体pEGFP-N1-FTO转染3T3-L1细胞48 h后,在显微镜下观察到绿色荧光的表达,说明FTO基因真核表达载体构建成功。本试验构建努比亚山羊FTO基因真核表达载体,其在3T3-L1细胞中成功表达,为以后研究FTO基因与山羊脂肪代谢的相关性奠定基础。     

广西巴马小型猪全身CT影像学观察

[目的]获取正常形态下广西巴马小型猪心血管系统、运动系统、呼吸系统、中枢神经系统和泌尿系统的电子计算机断层扫描(CT)影像图谱及各组织器官的测量数据,为广西巴马小型猪影像数据库建立及其后续研究提供参考依据.[方法]选取10头健康合格的12月龄广西巴马小型猪,公母各半,全身麻醉后置于CT诊断台上,采用头前尾后俯卧姿势,腹部正中矢状面垂直于扫描床平面并与床面长轴的中线重合,从头顶至足部连续进行扫描,并采用多平面重建(MPR)、最大密度投影(MIP)和容积再现技术(VR)等观察分析广西巴马小型猪各系统的解剖关系.[结果]将广西巴马小型猪原始容积数据进行图像重组,即可获得心血管、运动、呼吸、中枢神经和泌尿系统等五大系统的三维重建图像,同时测量获得各系统主要组织器官的相关数据,且发现公猪和母猪间差异不显著(P>0.05);但在获得的广西巴马小型猪CT影像图谱中肌肉、细小血管及神经等显示并不清晰,无法测量,致使各系统中的组织器官测量数据并不完全.[结论]通过CT技术对正常形态下的广西巴马小型猪进行全身影像观察及各组织器官数据测量,可实现不用屠宰解剖(活体)即能观察其内部结构,使广西巴马小型猪解剖学及疾病模型应用更直观.     

隆林山羊CIDEc基因的克隆及组织表达分析

【目的】明确隆林山羊诱导细胞凋亡DFF45样效应因子c基因（CIDEc）的生物学特性及其表达规律,为揭示CIDEc基因对山羊脂肪代谢的调控机制提供理论依据。【方法】提取隆林山羊背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹脂和皮下脂肪及努比亚山羊腹脂和皮下脂肪的总RNA,PCR扩增隆林山羊CIDEc基因编码区（CDS）序列,使用Ex-PASy、TMHMM Server v.2.0、ProtScale、NPS@SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测CIDEc基因在隆林山羊和努比亚山羊不同组织器官中的表达情况。【结果】隆林山羊CIDEc基因CDS序列全长为741 bp,共编码244个氨基酸残基,其编码蛋白分子量26.09 kD,不稳定系数48.44,脂肪指数100.7,理论等电点（pI）5.28,属于酸性蛋白,不存在跨膜结构,亲水性较强。隆林山羊CIDEc基因CDS序列与NCBI已公布的山羊CIDEc基因（XM_018038446.1）CDS序列相对比仅有1处碱基发生突变,即第560位点G突变为T,属于同义突变。隆林山羊与绵羊的CIDEc基因CDS序列相似性最高（99.0%）,与小鼠的相似性较低（79.6%）;基于CIDEc基因CDS序列相似性构建的系统发育进化树也显示隆林山羊与绵羊的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系较远。在隆林山羊CIDEc蛋白的二级结构中:α-螺旋占32.38%,β-转角占12.70%,延伸链占13.11%,无规则卷曲占41.80%。CIDEc基因在隆林山羊7个组织器官中均有表达,且在腹脂和皮下脂肪中高表达,极显著高于在其他器官组织的相对表达量（P<0.01）;CIDEc基因在努比亚山羊脂肪组织（皮下脂肪和腹脂）中的相对表达量显著高于在隆林山羊脂肪组织中的相对表达量（P<0.05）。【结论】CIDEc基因在隆林山羊各器官组织中均有表达,以在脂肪组织中的表达水平较高,且其在努比亚山羊脂肪组织（皮下脂肪和腹脂）中的表达水平显著高于在隆林山羊中的表达水平。可见,CIDEc蛋白是脂肪代谢的重要调节剂,与动物体内脂质存储密切相关。     

陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4（melanocortin-4 receptor,MC4R）基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999 bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906 bp处为同义突变,110和278 bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。     

2个品种山羊瘤胃菌群结构比较及其功能预测分析

【目的】阐明山羊瘤胃微生物特征及品种间的差异,为进一步研究不同山羊品种生长性能与瘤胃微生物群间的关系提供参考依据。【方法】随机挑选都安山羊和努比亚山羊健康母羊各3只,正常饲喂6个月后屠宰,采集经4层纱布过滤的瘤胃液2 mL,采用16S rDNA扩增子高通量测序技术分析都安山羊和努比亚山羊的瘤胃微生物区系特征及品种间的差...     

努比亚山羊KISS1基因多态性与繁殖性状的关联分析

【目的】明确转移抑制素基因（KISS1）多态性与努比亚山羊繁殖性状（产羔数、初生重和断奶重）的关联,为进一步展开山羊分子标记辅助选择育种提供参考依据。【方法】利用DNA混合池结合Sanger测序筛选出努比亚山羊KISS1基因SNP位点,再通过MTA-Seq测序对355只努比亚山羊群体进行SNP位点的基因分型,并采用SAS 9.2的一般线性模型（GLM）对KISS1基因SNP位点与努比亚山羊的产羔表型性状进行关联分析。【结果】在努比亚山羊KISS1基因内含子1发现2个SNP位点（g.1341600A>G和g.1341674C>G）。其中,g.1341600A>G位点处于中度多态（0.25P_HWE>0.05）;而g.1341674C>G位点处于低度多态（PIC<0.25）,已偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P_HWE<0.05）。g.1341600A>G位点GG和AG基因型个体的第一胎、第二胎及三胎联合产羔数均高于AA基因型个体,且在第一胎达显著水平（P<0.05,下同）;g.1341674C>G位点CC基因型个体则表现为第一胎、第三胎及三胎联合产羔数均高于GG基因型个体,同样在第一胎达显著水平。g.1341674C>G位点GG基因型个体的第一胎、第三胎及三胎联合羔羊初生重均高于CC基因型个体,且在第三胎达显著水平;g.1341600A>G位点不同基因型与努比亚山羊各胎次羔羊初生重无显著关联（P>0.05,下同）。在羔羊断奶重方面,2个SNP位点不同基因型与努比亚山羊各胎次断奶重也无显著关联。g.1341600A>G位点和g.1341674C>G位点可形成连锁不平衡单倍型模块,其中GC、AC、AG单倍型的频率分别为0.645、0.265和0.090;单倍型模块与第一胎产羔数显著关联,AACC组合型产羔数显著低于其他组合型。【结论】努比亚山羊KISS1基因内含子1存在2个SNP位点（g.1341600A>G和g.1341674C>G）与其繁殖性状相关,其中g.1341600A>G位点的A等位基因和g.1341674C>G位点的C等位基因可作为努比亚山羊选育的潜在分子标记,且在今后的育种过程中应淘汰KISS1基因AACC组合型母羊。