PRV、PPV双重PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够快速诊断猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的方法,根据GenBank上发表的PRV、PPV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增PRV、PPV的引物,经过条件优化后,建立检测PRV、PPV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为570bp、748bp。试验证明,该方法具有良好的特异性和敏感性,省时、省力、快速、敏感、高效的特点,为PRV与PPV的快速诊断试剂盒组装及流行病学的研究提供了技术支持。     

PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

大肠杆菌K99-ST1双价基因工程菌株的构建及其免疫原性

为了有效预防肠毒素性大肠杆菌引起的犊牛和羔羊腹泻,利用基因工程技术构建了融合基因K99-ST1及其原核表达载体,并时融合蛋白进行了初步免疫原性分析.结果显示,将PCR获得的K99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段借助pUCm-T载体,成功构建重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ+SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET30a中,成功构建表达载体pET-K99-ST1;将该表达载体转入表达菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到大小约31 000的蛋白;Western blotting显示,融合蛋白可以特异的与K99阳性血清反应;将BL21(DE3,pET-K99-ST1)诱导表达后免疫兔,ELISA检测K99抗体水平较高,乳鼠灌胃试验显示该菌株免疫后产生ST1抗体.这表明本试验已成功构建大肠杆菌K99-ST1双价基因工程菌株BL21(DE3,pET-K99-ST1),该菌株具有良好的免疫原性,为大肠杆菌K99-ST1双价基因工程疫苗开发奠定了基础.     

鸭疫里默氏菌2型分离鉴定及药敏试验

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的危害雏鸭的一种急性或慢性败血性传染病。其中以鸭疫里默氏菌2型对我国养鸭场造成的危害最大。本试验通过从山东、广西、四川等地分离的20株2型鸭疫里默氏菌分离株的生理生化、药敏试验发现:这20株2型菌分离株其生理生化特性一致;分离株表现不同程度的耐药性,对头孢噻肟钠、氟苯尼考、绿都肠乐、罗红霉素、阿奇霉素和阿莫西林敏感度较高。将20株分离菌株培养物分别接种15日龄健康雏鸭,每只颈部皮下注射1.0×106CFU/ml,观察10天。结果表明:20株分离株对15日龄雏鸭致病性差异较大,致死率从0到100%不等,其中sd-5株致病性最强,致死率为100%;其次分别为sd-4(致死率80%)和hy-2(致死率70%)。     

4株IBDV分离株VP2基因的序列分析及原核表达

RT-PCR扩增获得4株鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)分离株(GT、HN、ZB、BZ)VP2基因并测序,序列分析结果表明:各基因全长均为1356bp,编码452个氨基酸残基;核苷酸、氨基酸序列同源性分别在93.2%～99.9%与93.6%～100%之间;除HN株与经典毒株Cu-1核苷酸同源性为95.5%外,其余3株均为95.6%;GT、HN、ZB及BZ株与VariantE株核苷酸同源性均为95.9%;该4株病毒与北欧、非洲、西亚、东南亚、东亚等地区于1998～2008年报道的超强毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性均非常高。根据VP2蛋白氨基酸序列特征,HN、ZB、BZ株病毒皆为超强毒株(vvIBDV),GT株除254位氨基酸残基为变异株特征性的S(丝氨酸)外,其余均与超强毒株特征相符。以GT株VP2基因克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌BL21(DE3),低温培养后42℃热诱导,并对诱导产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果显示,目的基因获得表达,并与阳性抗体具有良好的反应原性,为以VP2为基础的基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。     

杉木种子园产量构成分析

以浙江横畈1. 5代杉木种子园为背景材料,对个体结实动态,群体结构与产量关系,球果经济性状和生态因素的影响进行了观察与分析。同时,概括出产量( P )的构成要素:即种植密度( d )、单株球果数( n )、果重( W )和出籽率( S ),并提出经验计算公式:P = d ( 100n W ) S 。1995年10年生杉木种子园获得种子243kg hm- 2 ,其群体结构是525株 hm- 2, 树冠郁闭度0. 6,单株结实量661. 9个,出籽率6. 2% 。     

灰色残差GM (1 , 1)模型在大气二氧化硫预测中的应用

应用灰色GM (1 , 1)模式理论与方法, 建立了临安市大气二氧化硫质量浓度的灰色残差预测方程x (t +1) =-0.107 432 e-0.095 872 t +0.123 917 , 并进行了预测。预测结果与实测值的相对误差绝对值介于0.56 %～ 14.51 %之间, 预测结果后验比与小误差概率分别为0.280 2 和1.0 。表明模型与实测值拟合程度好, 达到了较高精度。表3 参10     

关于序贯抽样检验

利用Wald 的序贯概率比检验中接收产品时对应的批检验数:n1 ＊(0 , c11), n2 ＊(1 , c12),, nk ＊(k -1 , c1k), , 设计出一种改进型序贯检验(其中当c1t s 时(t =1 , , s), 取c1t ＊=c1t ;当c1t s 时, 取c1t＊ =s):n1＊(0 , c11), n2 ＊(1 , c12＊), , ns ＊(s -1 , s)。证明了当次品率较小(p p0)时, 改进型序贯检验的平均抽检个数N ＊(p)与序贯概率比检验的N(p)比较接近, 但抽检周期要小得多。表1 参6     

冷弯薄壁型钢-钢混合结构双层墙体抗剪性能试验研究

采用拟静力试验对4个冷弯薄壁型钢钢混合结构双层墙体施加低周往复荷载,为研究了冷弯薄壁型钢钢混合结构双层墙体抗剪性能.为了考察斜撑的影响,对其中2个试件增加斜撑,试验得到了试件的破坏特征、荷载位移滞回曲线等.试验结果表明,冷弯墙体与钢框架无明显滑移与拔起,两者可以良好的共同工作;试验过程中,下部钢框架均处于弹性阶段,其滞回曲线均为"梭形",无捏缩现象,增强钢框架刚度对其抗剪性能影响不大,但是可以一定程度上缩小变形;上部冷弯墙体主要破坏特征为面板螺钉破坏及OSB板角部破碎;设置斜撑试件中柱龙骨破坏严重,柱顶和柱底均屈曲,斜撑在一定程度上增加了试件弹性阶段的刚度和抗剪性能.在冷弯薄壁型钢钢混合结构中,冷弯墙体与钢框架通过抗拔和抗剪螺栓形成可靠连接传递剪力与柱端附加轴力.冷弯薄壁型钢钢混合结构双层墙体可以发挥钢结构与冷弯结构的特点,实现底层大跨度,满足实际工程中的需要.     

SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达

为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。