禽流感病毒A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株NP及M1基因的克隆及序列分析

参照已发表的A型禽流感核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)基因序列及其基因组特性,设计合成了一条通用反转录引物和两对特异性引物,采用RT-PCR法,成功克隆了禽流感病毒国内分离株A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株的NP、M1基因.序列测定结果为NP基因cDNA全长1497bp,编码498个氨基酸.M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸.将其序列与数株A型流感病毒(H9N2)NP及M1基因序列进行比较,NP基因同源性为90.51%～98.46%,氨基酸序列同源性为95.38%～98.59%.M1基因同源性为90.78%～97.36%,氨基酸序列同源性为95.63%～99.60%.     

鸡新城疫病毒F蛋白的研究进展

鸡新城疫病毒为有囊膜的负链RNA病毒。NDV基因组编码6种结构蛋白：L蛋白为RNA依赖聚合酶，与核衣壳相联；HN～具有血凝素和神经氨酸酶活性，构成副粘病毒二种纤突中的大纤突；F为融合蛋白，构成小的纤突；NP为核衣壳蛋白；P为磷酸化的核衣壳相联蛋白；M为基质蛋白，是构成囊膜的支架。其中的融合蛋白是NDV的功能性糖蛋白之一，在致病和免疫应答过程中起重要作用。已成为研究NDV致病性的热点，为了使大家对NDV的F蛋白有个整体的认识，现综述如下。     

禽流感病毒分子生物学研究进展

禽流感是由A型流感病毒引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽的传染病。禽流感病毒H5N1亚型于1997年、H9N2亚型于1999年、H7N7亚型于2003年和H5N1亚型于2004年先后发生感染人的事件，人们不得不重新认识禽流感的公共卫生意义。本文综述了禽流感病毒的基因组、主要蛋白及其功能、毒力分子学基础、分子生物学诊断和疫苗研究等。     

马传染性贫血病毒基质蛋白p15单克隆抗体的制备

为制备抗马传染性贫病毒(EIAV)的单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的重组EIAV基质蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了抗EIAV基质蛋白p15抗体的杂交瘤细胞.应用重组p15和EIAV总蛋白为抗原建立的ELISA以及EIAV感染细胞的间接免疫荧光法,对杂交瘤细胞进行了有限稀释法筛选,获得了7株稳定分泌抗p15抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:1F12、1E2、1E3、4B10、4H7、5E5、4G5.这些抗p15 MAb均能与感染驴胎皮肤细胞的EIAV和经SDS-PAGE分离的EIAV总蛋白中的相应蛋白结合.抗体效价叠加实验表明,这7株MAb中含有至少3种识别不同抗原决定簇的抗体.这些p15 MAb的获得有助于对EIAV和慢病毒的深入研究.     

狂犬病毒HEP-Flury株基质蛋白的原核表达及纯化

为原核表达狂犬病毒(RV)基质蛋白(M),本研究以RV的HEP-Flury株全长重组质粒为模板扩增M基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-M并转化至宿主菌E.coli M15(pREP4),在IPTG的诱导下表达。SDS-PAGE电泳分析显示M蛋白为25ku。Western blot检测证明,重组蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及鼠抗狂犬病毒多克隆抗体特异识别。本研究为狂犬病诊断方法的建立奠定了基础。     

传染性造血器官坏死病毒-Sn株基质蛋白基因克隆及生物信息学分析

基质蛋白(matrix protein,M)是传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)主要结构蛋白之一,是病毒感染后造成细胞凋亡的主要作用蛋白。为分析IHNV M蛋白的序列及结构特征,研究利用敏感细胞(EPC)培养传染性造血器官坏死病毒-Sn分离株(IHNV-Sn),根据M蛋白基因开放阅读框(open reading frame,ORF)的序列设计引物,利用RT-PCR的方法克隆得到M蛋白全长ORF,并且构建至表达载体pET27b(+)中,构建出pET27-M重组质粒。生物信息学分析结果显示,M蛋白基因的序列长度为588 bp,编码195个氨基酸残基,推导分子量约为21.88 ku,等电点为9.35;氨基酸序列分析表明,M蛋白富含丝氨酸、苏氨酸以及碱性氨基酸,存在丰富的α-螺旋、β折叠和无规则卷曲;M蛋白不含有信号肽;疏水性大于亲水性;没有跨膜区存在;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,不存在N-糖基化位点,存在7个潜在的O-糖基化位点和15个潜在的磷酸化位点。系统进化树分析显示,IHNV-Sn株与美国分离株同为一簇。     

弹状病毒基质蛋白(Matrix protein)的研究进展

弹状病毒的基因组由1段线性单股不分节的负链RNA组成,主要编码5个结构蛋白,分别为核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Mattix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和RNA聚合酶(RNA polymerase,L).其中,基质蛋白(...     

H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的制备与鉴定

本研究用纯化的H9N2亚型禽流感病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的杂交瘤细胞：3G8、2F6、5F2。间接ELISA方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上。构建了真核表达载体pCAGGS-M1并转染于MDCK细胞,以用于腹水的Western blot和间接免疫荧光鉴定。间接免疫荧光结果表明,3株单克隆抗体皆与真核表达蛋白M1反应。这些单克隆抗体的制备为后期研究M1蛋白在流感病毒复制与出芽过程中的重要生物学功能奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感基质蛋白M1基因的原核表达和纯化

为获得纯度大于90%的M1蛋白,构建重组质粒PET-22b-M1,将正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测分析表达形式和表达量,并经Ni2+柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白。结果表明:试验成功构建了pET-22b-M1表达载体;IPTG诱导后高效表达出分子质量约为28 ku的M1融合蛋白;纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,且获得的M1蛋白纯度达95.4%。     

转H5禽流感病毒M2e基因烟草的研究

将禽流感病毒M2e与鸡IgG Fc的融合基因转入烟草植株,利用烟草生产禽流感抗原蛋白,探索利用植物作为生物反应器生产禽流感疫苗的可行性。将M2e-Fc融合基因克隆到植物表达载体pBI121中,与CaMV35s启动子相连,以烟草子叶作为外植体,利用农杆菌介导法将外源基因转入烟草中。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR分析。结果表明,M2e基因已经导入到烟草中,在转录水平得到了表达。为进一步利用转基因植物生产禽流感疫苗进行了前期的探索工作。