杨树微管功能研究植物表达载体构建及验证

[目的]分别构建84K杨的微管蛋白TUA5和TUB16与红色荧光蛋白mCherry融合的植物过表达载体,瞬时表达验证载体在植物体内表达后的荧光信号,为研究杨树微管功能奠定基础。[方法]以毛果杨微管蛋白TUA5和TUB16的基因序列为模板,设计84K杨的皿5和7TZB76基因的引物,提取野生型84K杨的RNA并反转录成cDNA,同源克隆得到84KTUA5和84KTUB16基因,分别连接在pCAMBIA 1300载体mCh-ep荧光标签的N,端和C端,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中,通过菌落PCR和测序鉴定获得阳性单克隆,并通过电击法将重组质粒转化到农杆菌GV3101中,瞬时转化烟草后进行荧光观察。[结果]克隆得到了84KTUA5和84KTUB16基因,成功与pCAMBIA 1300-mCherry载体连接,烟草瞬时表达荧光观察结果显示:仅目的基因与mCherry标签C,端相连的融合蛋白能够成功表达,且荧光明显。[结论]成功构建了84K杨皿5和TUB16基因与pCAMBIA 1300-mCherry的融合表达载体,为进一步研究杨树微管功能提供了背景材料。     

地域文化在公路景观设计中的应用

为促进公路沿线地区地域文化的延续和历史文脉的传承,营造具有丰富文化内涵并独具地方特色的公路景观。本文探讨了有关公路景观设计中地域文化应用的理论及方法,简述了当前地域文化应用于公路景观设计中存在的若干问题,总结了地域文化在公路景观设计中的应用原则和应用方法,分析了如何在公路景观的不同构成元素上表现地域文化。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

马疱疹病毒1型主要毒力基因分析及TK基因缺失载体的构建

为了解新疆马疱疹病毒1型（EHV-1）主要毒力基因遗传进化情况并构建TK基因缺失株，本研究以EHV-1 XJ2015株DNA为模板，对其主要毒力基因TK、gI和gE全长进行克隆、测序及生物信息学分析，并扩增TK基因左右重组臂TKL和TKR，构建质粒pUC-TKLR，将扩增后的增强绿色荧光蛋白（EGFP，含有CMV+polyA）插入pUC-TKLR质粒，构建TK基因缺失打靶质粒。TK、gI和gE基因同源性分析结果显示，XJ2015株与国外EHV-1分离株TK、gI和gE基因同源性均较高，分别为99.8%~100.0%、99.6%~100.0%和99.9%~100.0%；与EHV-3分离株同源性均最低，分别为72.9%、59.4%和62.1%；遗传进化分析显示，3个基因均与国外EHV-1同属于一个遗传进化分支，与EHV-9和EHV-4进化关系较近，但与EHV-3进化关系较远，表明XJ2015毒株与国外EHV-1毒株TK、gI、gE基因核苷酸上差异不明显，没有明显的地域性特征，功能基因保守且进化缓慢，同源基因功能相同或相近；经PCR扩增、酶切、测序及转染鉴定，本试验成功构建了用于TK基因缺失的打靶质粒pUC-TKLR-EGFP。通过对EHV-1主要毒力基因的分析及TK基因缺失打靶载体的构建，为新疆地区马鼻肺炎流行病学调查分析、TK基因缺失株的构建提供理论依据。     

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。     

利用CRISPR/Cas9系统编辑日本结缕草ZjSGR基因技术研究

日本结缕草(Zoysia japonica)是一种常见的具有众多优良性状的暖季型草种,秋冬季节在我国北方地区会较早出现叶片脱绿现象,在一定程度上限制了日本结缕草在北方的大面积使用。ZjSGR是从结缕草中分离出来的一种衰老诱导基因,负调控叶片滞绿性状。本研究利用CRISPR/Cas9系统,通过基因枪介导的遗传转化方法实现对日本结缕草ZjSGR基因的编辑,经测序验证获得1株单碱基缺失突变植株。突变植株叶片深绿,在正常生长温度(28~30℃)条件下,和对照相比,叶绿素含量更高(P<0.05)。本研究为进一步阐述ZjSGR基因在日本结缕草滞绿性状调控中的作用机理提供了基础研究材料,也为培育日本结缕草滞绿品种育种工作奠定了基础。     

猪RUVBL2真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

RUVBL2(RuvB-like 2)蛋白是进化上高度保守AAA+(ATPases Associated With Diverse Cellular Activities,AAA)家族成员之一,CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞被广泛地用于表达重组DNA蛋白。为探究猪睾丸组织的RUVBL2基因是否能够在CHO细胞中表达,本实验以猪睾丸组织的cDNA为模板,PCR扩增RUVBL2目的基因,并将其克隆至pIRES2-EGFP(Mammalian Expression Vectors pIRES2-EGFP)载体上,进一步转化到DH5α中,再进行PCR、酶切及测序鉴定;将重组质粒转染到CHO细胞中,再进行荧光、RT-PCR、Western blot检测。结果显示:PCR、酶切及测序都证实了RUVBL2基因正确地插入到了载体质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点;荧光、RT-PCR、Western blot也证实了RUVBL2基因在CHO细胞中的成功表达。本实验成功构建了猪的pIRES2-EGFP-RUVBL2真核表达载体,并证实了猪睾丸组织中的RUVBL2基因能够在CHO细胞中表达。     

对民族山区政府在发展农民合作社中的“尴尬”角色和定位的思考

2013年中央1号文件指出：“农民合作社是带动农户进入市场的基本主体,是发展农村集体经济的新型实体,是创新农村社会管理的有效载体。”要“加大力度、加快步伐发展农民合作社,切实提高引领带动能力和市场竞争能力。”