小菜蛾交配行为及能力的观察

观察在室内条件下小菜蛾的交配行为和能力,为探明小菜蛾[ Plutella xylostella(L.)]在自然条件下的交配规律提供参考.结果表明:成虫羽化后当天即可进行交配,雄虫可以多次交配；全天有3个交配高峰值,分别为12:30、0:30及6:30,羽化后第1d,交配率较低,羽化后2-4d交配率较高(71.4％ ～7...     

棉花新品种(系)抗棉铃虫鉴定与综合量化评估

通过室内苗期棉叶接幼虫与田间蕾铃期罩笼接蛾试验 ,对江苏省区试棉花新品种 (系 )进行抗棉铃虫鉴定。根据对棉铃虫幼虫存活、幼虫发育进度、叶片与蕾铃受害程度影响的测定结果 ,应用综合抗性值方法进行抗性综合量化评估。结果表明 ,南抗 7号对棉铃虫具高抗程度的综合抗性水平 ,TK9988、30、泗抗 1号、1 0 9B对棉铃虫接近高抗 ,GK31、盐抗1号、盐抗 1 1 0 7为中抗 ,KC2 36、新 71 8为低抗 ,而泗棉 3号则对棉铃虫无抗性 ,为利用抗虫棉花新品系提供了科学依据。     

抗虫棉新品系对棉铃虫抗性水平的综合量化评估

采用苗期叶片接虫与蕾铃期罩笼接蛾相结合的多期多指标综合量化评估鉴定方法,就2004年江苏省棉花品种区试13个抗虫棉新品系对棉铃虫的综合抗性水平进行鉴定。鉴定结果显示:B4、B5、B7、B8、B10、C9、H11、H22、I5为高抗,B2、B11、H9、H13为中抗。     

绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素（20E）对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数（发育历期、若虫体重及成虫羽化率）的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2 715 bp,开放阅读框2 106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区（RGS,54—175 aa）、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（S-TKc,191—454 aa）、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分（S-TK-X,455—534 aa）和PH结构域（PH,558—655 aa）,其中PH结构域是GRK2蛋白的典型结构域;系统发育分析结果表明,绿盲蝽GRK2与茶翅蝽GRK2亲缘关系最近;AlGRK2在绿盲蝽1—16日龄虫体内均有表达,mRNA表达量呈现出波动式下降的模式,在绿盲蝽初始龄期的表达量较高,而在末龄期的表达量显著下降;AlGRK2在绿盲蝽雌成虫卵巢和脂肪体中高表达,在胸与足中的表达量较低;外源20E处理后,AlGRK2在绿盲蝽1日龄和3日龄表达量显著下调,AlGRK2在雌成虫各组织中均表达上调,在卵巢及脂肪体中上调幅度最大,相反的是,20E信号通路中PLC抑制剂U73122处理的AlGRK2表达量下调;绿盲蝽若虫发育历期、末龄若虫体重和成虫羽化率均显著下降,相反的是,U73122处理组若虫期的发育历期显著延长;此外,与注射dsGFP处理组相比,注射dsAlGRK2处理后绿盲蝽的AlGRK2表达水平显著下降,若虫死亡率及发育历期显著增加,而成虫羽化率和5龄若虫体重均显著下降。【结论】AlGRK2在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;外源20E抑制剂及RNAi处理后,均可抑制AlGRK2的表达,同时还可对绿盲蝽生长发育产生不利影响,表现为延缓绿盲蝽的发育进度、降低5龄若虫体重及成虫羽化率。     

绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP）,获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%）,与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）;系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。     

基于COI及28SrDNA序列分析的扶桑绵粉蚧地理种群的遗传分化研究

扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)为危害棉花等经济作物安全生产的一种重要检疫性害虫。本研究分析了我国扶桑绵粉蚧6个地理种群(江苏、安徽、湖北、浙江、广东、广西)线粒体COI及核基因28S rDNA序列,结合中国海南、印度、巴基斯坦、美国地理种群的数据,分析了其可能的遗传分支。结果表明:扶桑绵粉蚧COI有7个单倍型,地理种群间显示出较小的遗传差异;28S rDNA序列在已测的中国六个地理种群中的结果高度保守,从核基因角度佐证了该种可能尚未出现种间分化。基于网络关系进化图、系统进化树分析得出扶桑绵粉蚧存在两个隐存谱系:((中国+印度+巴基斯坦)+美国加州)支系和美国佛罗里达支系;其中安徽及江苏种群应与入侵印度及巴基斯坦的支系为同一遗传支系。该研究结果可为探寻我国扶桑绵粉蚧的遗传进化和可能入侵途径提供参考。     

甜菜夜蛾卵黄原蛋白受体基因的RNA干扰

【目的】 卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor,VgR）是介导昆虫卵黄原蛋白胞吞作用的主要受体,通过RNA干扰（RNAi）方法研究甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）VgR的功能,为深入了解甜菜夜蛾生殖生理的分子机制及开发有效防治新方法提供依据。【方法】 以甜菜夜蛾雌成虫腹部的cDNA为模板,通过PCR克隆得到甜菜夜蛾VgR基因片段,其包含配体结合域功能区。绿色荧光蛋白基因（GFP）片段通过特异性引物从笔者实验室保存的GFP质粒上扩增。将VgR和GFP 目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析基因序列的准确性。以测序验证正确的质粒作为DNA模板,利用带T7启动子的引物进行PCR扩增。用T7 RiboMAX ^TM Express RNAi System合成试剂盒合成VgR-dsRNA和GFP-dsRNA。应用10 μL微量进样器在化蛹第2、6天的甜菜夜蛾雌蛹腹部注射3 μL双链RNA（2 μg·μL ^-1）。利用RT-qPCR技术检测甜菜夜蛾刚羽化、羽化24 h、羽化48 h雌成虫的VgR表达量变化,同时统计对照组（空白对照、注射GFP-dsRNA）和处理组（注射VgR-dsRNA）甜菜夜蛾的羽化率及单雌产卵量。【结果】扩增得到VgR和GFP基因片段,大小分别为327和417 bp。RT-qPCR 检测结果表明,与对照组相比,注射dsRNA后甜菜夜蛾的VgR表达水平显著下降。对于刚羽化、羽化24 h、羽化48 h的雌成虫,注射VgR-dsRNA处理组的VgR表达量相比注射GFP-dsRNA的对照组分别下降了79.35%、84.22%、67.68%。通过解剖观察刚羽化、羽化24 h、羽化48 h的甜菜夜蛾卵巢,发现注射VgR-dsRNA处理组与注射GFP-dsRNA对照组相比, 卵巢发育进度显著推迟。对于羽化24 h的甜菜夜蛾,与注射GFP-dsRNA组相比,注射VgR-dsRNA处理组卵巢管长度下降了23.92％;注射GFP-dsRNA组的卵巢成熟卵粒较多,平均直径为（0.46±0.05）mm,而注射VgR-dsRNA处理组成熟卵粒数量较少且相对较小,平均直径为（0.23±0.02）mm。注射GFP-dsRNA组和VgR-dsRNA组的羽化率无显著差异。注射VgR-dsRNA处理组的单雌平均产卵量只有170粒,而对照组（空白对照和注射GFP-dsRNA）单雌平均产卵量可达到451粒和420粒,处理组与对照组的产卵量存在显著差异。【结论】 通过体外注射dsRNA的方法研究VgR的功能,能够显著降低VgR表达。VgR在甜菜夜蛾的生殖中起着不可替代的作用,直接影响甜菜夜蛾卵巢的发育与产卵量,可以作为控制甜菜夜蛾的潜在靶标。     

侵染朱槿的木尔坦棉花曲叶病毒V2蛋白的亚细胞定位特征分析

木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）2006年在中国首次报道,并呈逐年扩散蔓延,给园艺和经济作物造成了严重损失。选择2012年采自江苏南京的CLCuMuV朱槿（Hibiscus rosa-sinensis）分离物作为研究对象,对其V2蛋白基因进行了扩增及克隆,并构建了V2-YFP融合表达载体,利用农杆菌浸润法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana）。激光共聚焦显微镜观察结果显示浸润处理后本氏烟叶片细胞的细胞质和细胞核周都有较强的绿色荧光信号,同时细胞质中还分布有点状的荧光信号。反转录PCR（RT-PCR）及蛋白质免疫印迹（Western blot）结果显示带荧光标签的V2在本氏烟叶片中转录和表达正常。这些结果说明CLCuMuV编码的V2蛋白主要分布在细胞质和细胞核周,同时在细胞质中还会形成小聚合体。     

不同寄主受绿盲蝽危害后生理代谢指标的变化

以绿盲蝽偏好程度不同的5种寄主植物为材料,利用生物化学方法分析了受绿盲蝽危害后各寄主体内生理代谢指标的变化。结果表明,受害后各寄主植物体内叶绿素与蛋白质含量均有不同程度的下降,下降率在10%～40%之间。可溶性糖含量的变化较大,绿盲蝽偏好程度较高的苜蓿与绿豆,糖含量较未受害对照分别高62.10%和31.90%,差异达显著水平。受害后除Bt棉体内游离脯氨酸含量明显下降外,其它寄主脯氨酸含量均增加,以大豆增加最显著(53.47%)。受害后寄主植物体内3种保护酶活性有增有减,但活性变化与偏好程度呈正相关性,5种寄主植物体内POD活性均增加,其中苜蓿增加最多(133.00%),仅大豆体内SOD活性下降(3.17%),苜蓿、大豆、甜叶菊体内CAT活性均下降。     

甜菜夜蛾SeKr-h1基因分子表达特性及其对保幼激素类似物的响应

Krüppel homolog 1(Kr-h1)是保幼激素(JH)的早期响应基因,在JH抑制幼虫或若虫变态及促进成虫生殖中发挥关键作用.利用RT-PCR技术克隆甜菜夜蛾SeKr-h1α基因,并进行了生物信息学分析,序列分析结果显示,SeKr-h1α开放阅读框长度1068 bp,编码355个氨基酸.与美国国家生物技术信息中心(NCBI)上已有的甜菜夜蛾Kr-h1β序列相比,SeKr-h1αN端缺少12个氨基酸.通过荧光定量qPCR研究甜菜夜蛾不同发育时期SeKr-h1α/β的表达水平,结果显示,SeKr-h1α/β表达趋势一致,SeKr-h1α为主要表达的转录产物.SeKr-h1α/β在幼虫末期、预蛹和成虫期高表达,1～4龄幼虫和蛹期维持低表达.在幼虫和蛹末期施用JH类似物Methoprene,qPCR检测SeKr-h1对JH的诱导响应表达,结果显示Methoprene处理5龄幼虫2、6、24 h都可诱导SeKr-h1表达,并且在处理6 h时的诱导效果最为明显,为对照的8.76倍;Methoprene处理化蛹末期的雌蛹,试验组羽化12 h雌虫SeKr-h1表达量为对照组的3.34倍.本研究克隆得到SeKr-h1α完整编码序列,并明确SeKr-h1的表达特性及其对JH类似物存在诱导响应,为进一步深入研究甜菜夜蛾SeKr-h1基因功能以及开发防控新策略奠定了良好基础.