4种不同性诱剂对玉米草地贪夜蛾诱集作用

为准确掌握草地贪夜蛾成虫发生动态,筛选对当地种群专一性强、灵敏度高的性诱剂,对深圳百乐宝生物农业科技有限公司(BLB)、宁波纽康生物技术有限公司(NK)、江苏宁录科技股份有限公司(NL)、南京新安中绿生物科技有限公司(XAZL)4个厂家生产的草地贪夜蛾性诱剂在江苏盐城市大丰区进行田间诱捕效果试验,探讨草地贪夜蛾性诱剂的使用技术。结果表明:4种不同性诱剂诱芯对草地贪夜蛾的诱集效果存在明显差异。BLB诱芯和NL诱芯可以有效监测草地贪夜蛾成虫田间发生动态,羽化高峰期明显,且峰值日期一致,NK诱芯诱集的成虫虫峰不明显,XAZL诱芯零星诱到成虫,无明显成虫高峰;BLB诱芯监测期内日均诱蛾量、最高单次诱蛾量、总诱蛾量均显著高于其他3种诱芯,其总诱蛾量达136.75头,分别是NL诱芯、NK诱芯、XAZL诱芯的1.47倍、4.76倍、10.52倍;通过对BLB诱芯进行持续30 d和持续60 d的诱捕对比试验,发现BLB诱芯1~30 d内诱捕性能稳定,诱蛾量大,31~60 d内日均诱蛾量、最高单次诱蛾量、总诱蛾量均有所下降且达显著水平,尤其是50 d后诱捕量下降明显。结果表明:BLB诱芯的诱蛾量大,能够明显反映出草地贪夜蛾的羽化高峰期,符合测报要求,更适合本地区草地贪夜蛾的监测,使用该诱芯时建议30 d更换1次。     

多年迷向防治对桃园梨小食心虫的控制作用评估

为了科学评估多年迷向防治对桃园梨小食心虫的实际防控效果,并完善优化桃园害虫性信息素科学应用技术,在江苏省无锡市惠山区5个乡镇大面积连片桃园内连续4年使用迷向丝防治梨小食心虫,并实时监测调查,分析各年度桃园内梨小食心虫种群消长动态,抽样法调查统计桃树折梢率。结果显示,多年迷向防治可以有效降低桃园梨小食心虫种群发生数量,各乡镇桃园内虫口基数逐年减少;洛社和钱桥2个乡镇2021年迷向防治处理区梨小食心虫平均迷向率在94.37%以上;2021年阳山镇迷向防治区平均折梢率为1.24%。结果表明大面积且连续使用迷向防治法对桃园梨小食心虫具有很好的防控效果。     

甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体制备及其在不同发育时期蛋白表达

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde Ⅰ和Xba Ⅰ限制性内切酶连接到原核表达载体pCzn1。将重组表达载体pCzn1-Vg转入大肠杆菌Arctic Express,离心收集诱导表达的菌液,超声波破碎菌体沉淀,取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测,分析Vg重组蛋白的可溶性。在不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白,筛选最优表达条件。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了Vg重组蛋白,将该蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗Vg血清抗体。采用间接ELISA方法检测血清抗体的效价,并通过Western blot法检测甜菜夜蛾雌虫不同发育阶段血淋巴中Vg蛋白的表达差异。【结果】扩增所得Vg基因片段为2 091 bp,编码697个氨基酸,预测蛋白分子量为80.88 k D。通过大肠杆菌表达出的Vg重组蛋白相对分子量为80 k D,其大小与预期的Vg重组蛋白带大小相符合。其主要以包涵体形式表达,而在上清中表达量不明显。不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白的结果显示温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1)时,Vg重组蛋白表达量最高。继续提高温度和IPTG浓度,对提高Vg重组蛋白的表达量无明显作用,且杂蛋白增多。新西兰白兔经4次免疫后,间接ELISA法检测表明,制备的兔抗Vg抗体具有较好的灵敏度,效价达到1﹕512 000。Western blot检测Vg蛋白在甜菜夜蛾不同发育阶段血淋巴中的表达,其杂交出的单一条带在180 k D左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期开始微弱表达。雌成虫羽化后血淋巴中Vg蛋白表达量先升高后降低,呈动态变化,到羽化48 h表达量最高,随后降低。【结论】纯化获得了Vg重组蛋白,并明确了最优表达条件(温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1));制备了高效价的甜菜夜蛾Vg多克隆抗体,明确了甜菜夜蛾Vg蛋白的表达规律。     

绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答

【目的】获得绿盲蝽(Apolygus lucorum)蜕皮激素受体(A1EcR-A)原核表达的重组蛋白,制备单克隆抗体,分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势,为进一步研究EcR的功能奠定前期基础,同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上,将含有其基因的T载体经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切,构建AlEcR-A原核表达载体(pCzn1-AlEcR-A),将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化,以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应,取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体,通过抗体纯化,Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白,从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法,进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫,分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化,明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应。【结果】经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白,且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在;经Ni-IDA亲和层析后,pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带,说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备,获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为8H7;Western blot分析表明,该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应,且条带大小一致,说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效;RT-PCR及Western blot结果表明,与注射蒸馏水相比,20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高,且随着处理时间的延长,其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的能稳定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株,20E有诱导AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用。     

绿盲蝽膜结合型海藻糖酶ALTre-2基因表达、纯化及酶学特性

以绿盲蝽为材料,在前期获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(ALTre-2)基因的基础上,构建了ALTre-2原核表达载体(pET28a-ALTre-2),经IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,获得具海藻糖酶活力的重组蛋白,最后在以海藻糖为底物及重组蛋白浓度为1.1 mg·mL-1的条件下,对纯化得到的重组ALTre-2蛋白进行活性检测,确定了其酶促反应的最佳pH和最适温度.试验结果表明:ALTre-2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够高效表达一个约60 kD大小的蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及蛋白纯化获得了具海藻糖酶活力的重组蛋白;该重组ALTre-2蛋白在pH为7.0时活性最高,同时重组ALTre-2蛋白酶活性最适温度是50℃.研究结果为深入探讨绿盲蝽膜结合型海藻糖酶分子调控机制奠定基础.     

不同品种棉田烟粉虱成虫种群动态及在棉株上的垂直分布

在长江下游的江苏沿江棉区,采用5点随机取样法对鲁棉研15号(Bt棉)、中棉所29号(Bt棉)和苏棉9号(常规棉)棉田烟粉虱成虫种群动态与在棉株上的垂直分布动态进行了系统调查.结果表明,Bt棉田烟粉虱成虫种群数量显著高于常规棉田,鲁棉研15号最高(58.4头/百叶),中棉所29号次之(39.3头/百叶),苏棉9号最低(29.4头/百叶);3种棉花植株上烟粉虱成虫种群消长的时序动态一致,7月中旬始见成虫,8月中下旬出现全年最高峰,10月下旬逐渐消失;烟粉虱成虫数量在3个品种棉花不同叶层均表现为上部叶>中部叶>下部叶.据此,提出了棉田烟粉虱施药防治技术.     

绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）雷帕霉素靶标全长基因（AlTOR）,研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素（20E）诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础。【方法】RACE法克隆AlTOR基因序列全长,qRT-PCR分析AlTOR表达特性以及在20E及其抑制剂U73122诱导下的应答响应;将含有AlTOR序列T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建原核表达载体pCzn1-AlTOR,经20℃、0.5 mmol·L^-1 IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,以获得AlTOR重组蛋白,最后再通过免疫,制备AlTOR蛋白多克隆抗体,Western blot评价该抗体的特异性。【结果】AlTOR的开放阅读框编码包含435个氨基酸,具有典型的TOR基因序列特征,即SIN1结构域、高度保守的CRIM结构域及PH域;AlTOR在绿盲蝽不同日龄、不同组织中均有表达,且在1日龄以及脂肪体中表达量最高;20E可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期AlTOR的表达,同时也能诱导成虫头、翅、卵巢和脂肪体中AlTOR表达上调,分别上调200.00%、118.89%、20.53%和60.82%,而U73122在中肠和卵巢中会显著抑制AlTOR的表达。经双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,命名为pCzn1-AlTOR;IPTG诱导的重组质粒可特异性表达一个约36 kD的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经Ni-IDA亲和层析纯化后,仅在36 kD附近有一条明显的特异性条带。进一步免疫及间接ELISA方法确定抗血清对TOR蛋白的效价,Western blot分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与AlTOR重组蛋白及绿盲蝽3龄若虫总蛋白结合,说明制备的AlTOR多克隆抗体特异性较好,可以用于后续的蛋白研究。【结论】AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;20E及其抑制剂诱导后,AlTOR呈现出相反的应答反应;本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性。     

转野生荠菜凝集素基因棉花对棉蚜的抗性鉴定

利用人工网室对45个转野生荠菜凝集素(WSA)基因棉花工程植株进行抗棉蚜鉴定,结果表明,38个转WSA基因棉花工程植株对棉蚜虫口密度的控制效果达到65%以上,蚜害级别均为Ⅰ级。南繁种植转化一代,标记基因(卡那霉素抗性基因)检测结果,38个株行抗、感植株分离比例符合3∶1,WSA基因是以单一位点整合到棉花染色体组中,不存在多个位点的整合方式;纤维品质测定结果,其中的9个株行达到高品质棉标准。与受体品种相比,9个高品质转WSA基因棉花株系对棉蚜虫口密度的控制效果达65.23%~74.39%,蚜害指数减退率皆达到80%以上,对棉蚜的抗性达到高抗水平。并对转WSA基因棉花植株上未出现死亡棉蚜的原因进行了讨论。     

性信息素诱杀防治甜菜夜蛾的技术效应

采用不同密度性诱盆处理与常规化学防治处理的对比试验方法,综合评估性信息素防治甜菜夜蛾的作用和效应.结果显示:性诱盆放置密度直接影响诱获雄蛾的频次与平均日单盆诱蛾量,低密度处理(1 hm2放置3个性诱盆)与高密度处理(1 hm2放置15个性诱盆)诱获雄蛾频次分别为71.22%与48.50%;平均日单盆诱蛾量在3头以上和3头以下的天数,低密度处理分别为29 d和38 d,分别占总诱蛾日的43.30%和56.70%,而高密度处理平均分别为7 d和60 d,分别占总诱蛾日的10.50%与89.50%;按单位面积诱捕雄蛾量计算,高密度处理雄蛾诱杀效果较低密度处理提高93.90%;在甜菜夜蛾主害代以1 hm2放置15个性诱盆的密度进行性诱防治,性诱防治区累计诱捕雄蛾874头,对幼虫的控制效果与常规化学防治相当.表明,应用昆虫性信息素诱杀防治主害代甜菜夜蛾可作为减少化学农药的无公害防治手段列入甜菜夜蛾综合防治体系中.