绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答

【目的】获得绿盲蝽(Apolygus lucorum)蜕皮激素受体(A1EcR-A)原核表达的重组蛋白,制备单克隆抗体,分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势,为进一步研究EcR的功能奠定前期基础,同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上,将含有其基因的T载体经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切,构建AlEcR-A原核表达载体(pCzn1-AlEcR-A),将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化,以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应,取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体,通过抗体纯化,Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白,从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法,进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫,分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化,明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应。【结果】经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白,且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在;经Ni-IDA亲和层析后,pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带,说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备,获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为8H7;Western blot分析表明,该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应,且条带大小一致,说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效;RT-PCR及Western blot结果表明,与注射蒸馏水相比,20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高,且随着处理时间的延长,其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的能稳定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株,20E有诱导AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用。     

甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体制备及其在不同发育时期蛋白表达

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde Ⅰ和Xba Ⅰ限制性内切酶连接到原核表达载体pCzn1。将重组表达载体pCzn1-Vg转入大肠杆菌Arctic Express,离心收集诱导表达的菌液,超声波破碎菌体沉淀,取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测,分析Vg重组蛋白的可溶性。在不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白,筛选最优表达条件。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了Vg重组蛋白,将该蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗Vg血清抗体。采用间接ELISA方法检测血清抗体的效价,并通过Western blot法检测甜菜夜蛾雌虫不同发育阶段血淋巴中Vg蛋白的表达差异。【结果】扩增所得Vg基因片段为2 091 bp,编码697个氨基酸,预测蛋白分子量为80.88 k D。通过大肠杆菌表达出的Vg重组蛋白相对分子量为80 k D,其大小与预期的Vg重组蛋白带大小相符合。其主要以包涵体形式表达,而在上清中表达量不明显。不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白的结果显示温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1)时,Vg重组蛋白表达量最高。继续提高温度和IPTG浓度,对提高Vg重组蛋白的表达量无明显作用,且杂蛋白增多。新西兰白兔经4次免疫后,间接ELISA法检测表明,制备的兔抗Vg抗体具有较好的灵敏度,效价达到1﹕512 000。Western blot检测Vg蛋白在甜菜夜蛾不同发育阶段血淋巴中的表达,其杂交出的单一条带在180 k D左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期开始微弱表达。雌成虫羽化后血淋巴中Vg蛋白表达量先升高后降低,呈动态变化,到羽化48 h表达量最高,随后降低。【结论】纯化获得了Vg重组蛋白,并明确了最优表达条件(温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1));制备了高效价的甜菜夜蛾Vg多克隆抗体,明确了甜菜夜蛾Vg蛋白的表达规律。     

不同品种棉田烟粉虱成虫种群动态及在棉株上的垂直分布

在长江下游的江苏沿江棉区,采用5点随机取样法对鲁棉研15号(Bt棉)、中棉所29号(Bt棉)和苏棉9号(常规棉)棉田烟粉虱成虫种群动态与在棉株上的垂直分布动态进行了系统调查.结果表明,Bt棉田烟粉虱成虫种群数量显著高于常规棉田,鲁棉研15号最高(58.4头/百叶),中棉所29号次之(39.3头/百叶),苏棉9号最低(29.4头/百叶);3种棉花植株上烟粉虱成虫种群消长的时序动态一致,7月中旬始见成虫,8月中下旬出现全年最高峰,10月下旬逐渐消失;烟粉虱成虫数量在3个品种棉花不同叶层均表现为上部叶>中部叶>下部叶.据此,提出了棉田烟粉虱施药防治技术.     

中国大鲵子二代制种技术的研究

为了推动中国大鲵人工生态繁殖和迁地保护的成功 ,系统介绍了中国大鲵子二代制种的技术路线 ,首先收集野生中国大鲵经人工驯养成为亲本种鲵 ,种鲵进行人工催产获得卵子、精子 ,经人工授精产生受精卵 ,再经人工孵化获得子一代幼苗 ,子一代经人工培育 2～ 3年产生子一代后备种鲵 ,再通过生理生态人工强化培育获得 1998年、1999年子一代亲本 ,然后经人工繁殖产生子二代大鲵 ,子二代大鲵可以放归自然保护区或供科研、观赏、商品鲵等利用。从 1998～ 2 0 0 3年共生产子一代 1 5万余尾 ,2 0 0 2年生产子二代 12 6 0尾 ,2 0 0 3年 4 80 6尾 (2年合计子二代 6 6 0 6尾 ) ,种群数量从最初的 1996年的 10 0尾增加到 2 0 0 3年的 2 31万尾 ,增长2 31倍 ,实践证明 ,此技术路线正确、可行。     

野生中国大鲵与人工繁殖子一代雄性形态及精液特性的比较

大鲵人工繁殖子一代雄鲵与野生雄鲵在体重均为3.25kg时,肥满度分别为0.6115和0.5483;在全长均为65cm时,肥满度分别为0.9103和0.7280,因此子代雄鲵比野生雄鲵略显肥短。进行二次催产率试验,野生雄鲵催产率为28.6%～37.5%,1998年子一代雄鲵催产率为75%～80.2%,1999年子一代雄鲵催产率为72.2%,子代比野生代催产率显著高(P<0.05)。在体重相同时,子代雄鲵精液量比野生雄鲵精液量多20%～40%,最大精液量一尾雄鲵可挤30～40mL,精子密度子代比原种稍高,最高密度为(5.52～8.3)×106ind/mL,精子体积占精液的8.0%～13.3%。pH值均为弱酸性或中性(6.4～7.1);精子大小为(170～210)μm×(3.8～4.5)μm。     

绿盲蝽膜结合型海藻糖酶ALTre-2基因表达、纯化及酶学特性

以绿盲蝽为材料,在前期获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(ALTre-2)基因的基础上,构建了ALTre-2原核表达载体(pET28a-ALTre-2),经IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,获得具海藻糖酶活力的重组蛋白,最后在以海藻糖为底物及重组蛋白浓度为1.1 mg·mL-1的条件下,对纯化得到的重组ALTre-2蛋白进行活性检测,确定了其酶促反应的最佳pH和最适温度.试验结果表明:ALTre-2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够高效表达一个约60 kD大小的蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及蛋白纯化获得了具海藻糖酶活力的重组蛋白;该重组ALTre-2蛋白在pH为7.0时活性最高,同时重组ALTre-2蛋白酶活性最适温度是50℃.研究结果为深入探讨绿盲蝽膜结合型海藻糖酶分子调控机制奠定基础.     

取食不同寄主植物对绿盲蝽热激蛋白AlHSP90表达的影响

绿盲蝽热激蛋白90基因AlHSP90是绿盲蝽体内重要的抗逆基因,参与绿盲蝽耐受高温、杀虫剂等胁迫反应。为了明晰绿盲蝽取食不同寄主植物后其体内抗逆基因的表达特征,本试验通过荧光定量PCR和Western杂交技术,重点分析AlHSP90基因及其蛋白在绿盲蝽取食不同寄主植物后的表达谱。结果表明:绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);与对照四季豆相比,取食茼蒿之后AlHSP90表达量无显著变化(P0.05)。雌成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量分别比对照上升了1.77、1.74倍;而雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量则分别比对照上升了1.98、1.94倍。取食不同寄主植物之后,AlHSP90蛋白的表达谱结果与其基因的表达谱结果高度相似。绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90蛋白表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);而取食茼蒿之后,AlHSP90蛋白表达量无显著变化(P0.05)。由此可见,AlHSP90基因是绿盲蝽适应棉花取食过程中重要的抗逆基因,并在绿盲蝽寄主转换过程中起到重要作用。     

苘麻对甘蓝田烟粉虱诱集效果及药剂防治评价

本文针对烟粉虱Bemisia tabaci在不同寄主苘麻Abutilon theophrasti Medic和甘蓝Brassinca oleracea上的嗜好性、趋性、田间种群动态进行了研究,并设计苘麻不同种植方式和配套施药评价苘麻对烟粉虱的诱集防治效果。室内趋性试验结果表明,接虫60h后苘麻上的成虫数是甘蓝上的5.5倍,若虫数为4.7倍。在大田甘蓝生育期内,苘麻对烟粉虱成、若虫的诱集效果分别可达76.8%和60.1%,说明苘麻对烟粉虱具极显著的诱集作用。苘麻不同种植方式诱集烟粉虱的效果结果表明,点状分布种植格局上的烟粉虱成、若虫数量与条状和片状分布种植上烟粉虱数量相比差异显著。配套施药试验结果表明,苘麻喷施10%吡虫啉可湿性粉剂,10%高渗四氟乳油,1.8%阿维菌素乳油,0.3%印楝素乳油,25%阿克泰水分散粒剂5种药剂7d后对烟粉虱成、若虫的防治效果分别为74.38%～94.86%和68.91%～93.29%,以阿克泰和阿维菌素防治效果最好。     

不同光周期对绿盲蝽实验种群生命表参数的影响

 为探明光周期对绿盲蝽种群增殖的影响，应用种群生命表的方法（温度（25±1）℃、相对湿度（70±5）%、光照强度4000 lx），系统研究了绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür )在5个光周期L︰D=8︰16，10∶14，12︰12， 14︰10和16︰8下的实验种群的生长发育特性和繁殖能力。结果表明，不同光周期处理下绿盲蝽各虫态存活率、产卵前期及产卵量等均有显著性差异。不同光周期处理下，绿盲蝽最高孵化率（L︰D=10︰14）比最低孵化率（L︰D=16︰8）高25.06个百分点；若虫最高存活率（L︰D=8︰16）比最低存活率（L︰D=16︰8）高25.26个百分点；雌成虫最高平均产卵量（L︰D=12︰12）比最低平均产卵量（L︰D=8︰16）多27.29粒。综合来看，光周期L︰D=12︰12处理下的绿盲蝽种群内禀增长率(rm)最大（0.1093），种群加倍时间（DT）最短（6.3417），表明该光周期处理十分有利于绿盲蝽种群的发育与繁殖。     

转Bt棉与常规棉受中黑盲蝽危害后生理代谢指标的变化

以常规棉苏棉9号及转Bt棉鲁棉研15、中棉所29为材料,采用生物化学方法分析了受中黑盲蝽危害后各品种棉株内生理指标的变化。结果表明:对照组棉株体内各代谢指标随着自身生长发育有一定程度的变化,但处理组棉株各生理指标波动幅度较对照组更大。受害后,叶绿素的增长率明显下降,蛋白质与可溶性糖含量均呈下降趋势,且处理组棉株下降率较对照组更显著;处理组游离脯氨酸增长率分别比对照组高4.56%、25.26%和3.99%;保护酶活性变化差异较大,与对照组相比,苏棉9号3种酶活性均下降,鲁棉研15仅CAT酶活性明显增强,而中棉所29POD酶活性呈增长趋势。表明:常规棉与转Bt棉对中黑盲蝽的耐性与补偿能力并未形成明显差异。