绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。     

绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）雷帕霉素靶标全长基因（AlTOR）,研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素（20E）诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础。【方法】RACE法克隆AlTOR基因序列全长,qRT-PCR分析AlTOR表达特性以及在20E及其抑制剂U73122诱导下的应答响应;将含有AlTOR序列T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建原核表达载体pCzn1-AlTOR,经20℃、0.5 mmol·L^-1 IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,以获得AlTOR重组蛋白,最后再通过免疫,制备AlTOR蛋白多克隆抗体,Western blot评价该抗体的特异性。【结果】AlTOR的开放阅读框编码包含435个氨基酸,具有典型的TOR基因序列特征,即SIN1结构域、高度保守的CRIM结构域及PH域;AlTOR在绿盲蝽不同日龄、不同组织中均有表达,且在1日龄以及脂肪体中表达量最高;20E可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期AlTOR的表达,同时也能诱导成虫头、翅、卵巢和脂肪体中AlTOR表达上调,分别上调200.00%、118.89%、20.53%和60.82%,而U73122在中肠和卵巢中会显著抑制AlTOR的表达。经双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,命名为pCzn1-AlTOR;IPTG诱导的重组质粒可特异性表达一个约36 kD的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经Ni-IDA亲和层析纯化后,仅在36 kD附近有一条明显的特异性条带。进一步免疫及间接ELISA方法确定抗血清对TOR蛋白的效价,Western blot分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与AlTOR重组蛋白及绿盲蝽3龄若虫总蛋白结合,说明制备的AlTOR多克隆抗体特异性较好,可以用于后续的蛋白研究。【结论】AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;20E及其抑制剂诱导后,AlTOR呈现出相反的应答反应;本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性。     

性信息素诱杀防治甜菜夜蛾的技术效应

采用不同密度性诱盆处理与常规化学防治处理的对比试验方法,综合评估性信息素防治甜菜夜蛾的作用和效应.结果显示:性诱盆放置密度直接影响诱获雄蛾的频次与平均日单盆诱蛾量,低密度处理(1 hm2放置3个性诱盆)与高密度处理(1 hm2放置15个性诱盆)诱获雄蛾频次分别为71.22%与48.50%;平均日单盆诱蛾量在3头以上和3头以下的天数,低密度处理分别为29 d和38 d,分别占总诱蛾日的43.30%和56.70%,而高密度处理平均分别为7 d和60 d,分别占总诱蛾日的10.50%与89.50%;按单位面积诱捕雄蛾量计算,高密度处理雄蛾诱杀效果较低密度处理提高93.90%;在甜菜夜蛾主害代以1 hm2放置15个性诱盆的密度进行性诱防治,性诱防治区累计诱捕雄蛾874头,对幼虫的控制效果与常规化学防治相当.表明,应用昆虫性信息素诱杀防治主害代甜菜夜蛾可作为减少化学农药的无公害防治手段列入甜菜夜蛾综合防治体系中.     

棉田烟粉虱成虫空间分布型与序贯抽样技术

为探讨烟粉虱成虫在长江下游的江苏沿江棉区不同棉田(Bt棉和常规棉)的种群空间分布型,指导田间取样,本研究应用5种空间分布型聚集度指标和2种回归方法(Iwao回归法及Taylor幂法则),于2008年测定和分析了烟粉虱成虫的空间分布格局.结果表明:烟粉虱成虫种群不论在Bt棉田还是在常规棉田,种群空间分布格局均一致,8月1日之前和10月3日以后,烟粉虱成虫在3个不同品种棉田中都呈均匀分布;8月1只至10月3日期间,符合聚集分布的检验标准.本文还探讨了影响其聚集的原因,并利用分布型参数确定了棉田烟粉虱成虫的理论序贯抽样数.     

取食不同寄主植物对绿盲蝽热激蛋白AlHSP90表达的影响

绿盲蝽热激蛋白90基因AlHSP90是绿盲蝽体内重要的抗逆基因,参与绿盲蝽耐受高温、杀虫剂等胁迫反应。为了明晰绿盲蝽取食不同寄主植物后其体内抗逆基因的表达特征,本试验通过荧光定量PCR和Western杂交技术,重点分析AlHSP90基因及其蛋白在绿盲蝽取食不同寄主植物后的表达谱。结果表明:绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);与对照四季豆相比,取食茼蒿之后AlHSP90表达量无显著变化(P0.05)。雌成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量分别比对照上升了1.77、1.74倍;而雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量则分别比对照上升了1.98、1.94倍。取食不同寄主植物之后,AlHSP90蛋白的表达谱结果与其基因的表达谱结果高度相似。绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90蛋白表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);而取食茼蒿之后,AlHSP90蛋白表达量无显著变化(P0.05)。由此可见,AlHSP90基因是绿盲蝽适应棉花取食过程中重要的抗逆基因,并在绿盲蝽寄主转换过程中起到重要作用。     

不同光周期对绿盲蝽实验种群生命表参数的影响

 为探明光周期对绿盲蝽种群增殖的影响,应用种群生命表的方法（温度（25±1）℃、相对湿度（70±5）%、光照强度4000 lx）,系统研究了绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür )在5个光周期L︰D=8︰16,10∶14,12︰12, 14︰10和16︰8下的实验种群的生长发育特性和繁殖能力。结果表明,不同光周期处理下绿盲蝽各虫态存活率、产卵前期及产卵量等均有显著性差异。不同光周期处理下,绿盲蝽最高孵化率（L︰D=10︰14）比最低孵化率（L︰D=16︰8）高25.06个百分点;若虫最高存活率（L︰D=8︰16）比最低存活率（L︰D=16︰8）高25.26个百分点;雌成虫最高平均产卵量（L︰D=12︰12）比最低平均产卵量（L︰D=8︰16）多27.29粒。综合来看,光周期L︰D=12︰12处理下的绿盲蝽种群内禀增长率(rm)最大（0.1093）,种群加倍时间（DT）最短（6.3417）,表明该光周期处理十分有利于绿盲蝽种群的发育与繁殖。     

转Bt棉与常规棉受中黑盲蝽危害后生理代谢指标的变化

以常规棉苏棉9号及转Bt棉鲁棉研15、中棉所29为材料,采用生物化学方法分析了受中黑盲蝽危害后各品种棉株内生理指标的变化。结果表明:对照组棉株体内各代谢指标随着自身生长发育有一定程度的变化,但处理组棉株各生理指标波动幅度较对照组更大。受害后,叶绿素的增长率明显下降,蛋白质与可溶性糖含量均呈下降趋势,且处理组棉株下降率较对照组更显著;处理组游离脯氨酸增长率分别比对照组高4.56%、25.26%和3.99%;保护酶活性变化差异较大,与对照组相比,苏棉9号3种酶活性均下降,鲁棉研15仅CAT酶活性明显增强,而中棉所29POD酶活性呈增长趋势。表明:常规棉与转Bt棉对中黑盲蝽的耐性与补偿能力并未形成明显差异。     

光周期对绿盲蝽生长发育和繁殖的影响

为探讨光周期对绿盲蝽种群调控的影响,完善其室内饲养与扩繁增殖技术,采用种群生命参数方法,分析了5种不同光周期处理[光照与黑暗时间比(L∶D)分别为24∶0、18∶6、12∶12、6∶18、0∶24]对绿盲蝽实验种群生长发育、存活及繁殖的影响。结果表明,5种光周期处理下绿盲蝽的成若虫期、成虫产卵期、卵量、孵化率、成虫体重及寿命等均存在显著差异。在光照时间大于12 h处理下,绿盲蝽的世代历期、成若虫存活率等生命指标明显偏高,但雌性比率随着光照时间的延长而逐渐下降。在光周期处理为12∶12时绿盲蝽种群趋势指数最高(19.44),而在全黑暗(0∶24)时,其单雌产卵量(76粒)、卵孵化率(55.80%)及种群趋势指数(9.76)均最低。说明较长时间的光照更有利于绿盲蝽种群数量的增加。     

栽培模式与施氮量对棉田节肢动物群落结构及稳定性的影响

【目的】 分别在长江下游沿海棉区(大丰) 和沿江棉区(南京),以早熟常规棉中棉所50号为材料,研究不同栽培模式和施氮量双因素对棉田节肢动物群落结构及稳定性的影响。【方法】 直播棉田以棉花3叶期为起始日期,移栽棉田以移栽后第3 d为起始日期,采用随机调查法,调查整株棉花所有器官,记录棉株上节肢动物的种类及数量。【结果】 栽培措施对棉田天敌亚群落个体数及益害比作用显著,且趋势一致,移栽棉田更有利于天敌发生,益害比更高,不同施氮量对棉田昆虫无明显影响。棉田中主要是棉蚜、烟粉虱、绿盲蝽和花蓟马等刺吸式害虫,主要天敌草蛉、蜘蛛和瓢虫。棉蚜、朱砂叶螨、花蓟马、烟粉虱和绿盲蝽在8月中下旬和9月上中旬发生数量较集中,其中直播棉田棉蚜、朱砂叶螨发生数量相对较多,移栽棉田花蓟马和绿盲蝽发生量相对较多,不增施氮肥棉田花蓟马发生数量相对较多,烟粉虱在棉田间均有发生,且数量较多。草蛉在8月下旬和9月上中旬发生数量大。6月下旬和7月上中旬蜘蛛和瓢虫发生数量大。其中移栽棉田蜘蛛和瓢虫发生量相对较多,增施氮肥棉田草蛉和瓢虫发生数量相对较多。害虫亚群落在南京移N₀棉田中多样性指数和均匀度指数显著高于直N₀棉田,优势集中性指数则相反;天敌亚群落在大丰移N₁₀棉田多样性指数和均匀度指数显著高于直N₀棉田,优势集中性指数则相反。【结论】 棉田昆虫消长动态及发生量因栽培措施和施氮量不同而略有差异。害虫亚群落在移栽方式且不施氮肥的棉田中群落稳定性最高,而天敌亚群落在移栽且增施氮肥的棉田中稳定性最高。节肢动物群落稳定性在各处理间无显著差异。     

转Gbve1基因棉对棉田动物群落结构及稳定性影响

【目的】 以亲本棉为对照,研究5组转Gbve1基因棉花株系对棉田生物群落分布以及环境的影响。【方法】 以棉花3叶期为起始日期,采用随机调查法,查看整株棉花所有器官,记录棉株上所见节肢动物的种类及数量。【结果】 转Gbve1基因棉田主要害虫的相对多度除朱砂叶螨、烟粉虱和棉叶蝉 与对照棉田间有显著差异外,其余主要害虫均无显著差异(P>0.05)。不同品系棉田中刺吸式害虫和咀嚼式害虫之间均无显著差异(P>0.05);而转Gbve1基因棉田中物种多样性指数、均匀度指数和优势集中性指数与对照相比均差异不显著(P>0.05);且转基因棉田与对照棉田节肢动物群落存在较高的相似性(0.681 4 ~ 0.820 9)。【结论】 不同品系棉田中主要昆虫群落消长动态显示,除个别品系在个别生育时期、个别昆虫之间存在显著差异,其余与对照相比消长动态均无显著差异,表明转抗黄萎病基因棉花并不影响棉田动物群落的结构和稳定性。