猪精子RNA提取及cDNA质量检测

为了有效分离猪精子RNA,试验通过精子上游法获得纯净精子样本,采用改良TRIzol法提取精子总RNA,经核酸测定仪及琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和质量,RT-PCR检测相应体细胞标记基因E-Cadherin、CD4和c-kit。结果表明:研究建立的精子RNA提取法可获得高质量的RNA,浓度约为203 ng/μL,OD260/280值为1.99,并且无其他体细胞标记基因扩增产物,可用于猪精子mRNA的研究。     

转座子介导细胞质显微注射技术的基因转移效率比较

为了比较和探索SB(sleeping beauty)、PB(piggyBac)和T012 3种转座子介导下的细胞质显微注射法在小鼠(Mus musculus)和斑马鱼(Danio rerio)上的转基因效率,本研究将包含3种转座子的重组载体pT3-PST-CAG-GFP分别与3种转座酶表达载体以1:1质量比混合,显微注射至小鼠和斑马鱼受精卵细胞质,经体外培养后在胚胎发育不同时期用荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率,结果显示,在培养至4 Ed(96 h)(Ed: embryo day,胚胎发育的天数)的小鼠胚胎中,PB转座子介导的GFP转基因阳性率最高,达52％(N=281),显著高于SB的47％ (N=328)和To12的36％ (N=273)(P＜0.05);而受精后36和60 h (hour past fertilization,hpf)斑马鱼胚胎中,荧光显微镜检测表明,To12的GFP阳性率分别为36％(N=677)和37％(N=685),显著高于SB(28％ N=691和27％ N=708)和PB(30％ N=687和32％ N=675)(P＜0.05);转座子介导的细胞质显微注射可获得较高的转基因效率,且转座子活性具有物种差异性,在哺乳动物胚胎中PB转座子的基因转移效率最高,而在鱼类胚胎中To12转座子的基因转移效率最高.本研究为提高动物转基因效率研究提供重要参考资料.     

猪精子SPMI和Spermadhesins mRNA表达水平与精子活力的关联

为了解析猪(Sus scrofa)精子中精子黏附蛋白基因家族(Spermadhesins)和精子运动抑制因子SPMI基因的表达与生物功能的关系,本研究采用精子上游法获得高低活力精子,结合体细胞标记基因分析检测所制备的精子RNA纯度,最后应用半定量RT-PCR技术分析高低活力精子mRNA表达差异。RT-PCR电泳显示,高活力精子中所有AQN1、AQN3、AWN(精子黏附蛋白基因家族)、PSPⅠ(猪精液蛋白1)、PSPⅡ(猪精液蛋白2)和SPMI的mRNA表达丰度均低于低活力精子。单因素方差分析显示,低活力精子组中AQN1、AQN3、AWN、PSPⅠ、PSPⅡ和SPMI mRNA相对表达水平均显著高于高活力精子组。研究结果提示Spermadhesins和SPMI基因在精子中的mRNA表达水平有可能作为精子活力的分子标记,从而为猪分子育种提供参考。     

姜曲海瘦肉型品系亲本母猪早期体重增长及体尺变化的研究

本试验测定了姜曲海瘦肉型品系亲本母猪初生、15、30、45、60、75日龄的体重和体尺。结果表明:姜曲海瘦肉型品系亲本母猪的平均日增重随着日龄的增长而不断提高,但是相对生长率呈不断下降趋势。初生、75日龄的胸围指标与体重呈显著相关(P<0.05),而30日龄的胸围与体重呈极显著相关(P<0.01)。75日龄的体长、管围、体高、胸围各指标与体重均相关显著(P<0.05)。     

梅山猪UBE2b基因的克隆及组织表达特征的研究

UBE2b基因编码的泛素结合酶参与的泛素-蛋白酶通路(UPP)在哺乳动物精子发生中起着重要作用。本研究根据相关ESTs拼接的序列采用PCR扩增鉴定的方法获得梅山猪UBE2b基因cDNA全序列,对其序列进行生物信息学分析,利用半定量RT-PCR的方法研究150日龄梅山公猪UBE2b基因的组织表达特征和不同日龄(2、30、60、90、150日龄)公猪睾丸的表达规律。结果表明:梅山猪UBE2b基因cDNA全长1 329 bp,编码153个氨基酸,具有UBCc家族的保守结构域。该基因编码氨基酸序列在不同物种间具有较高的保守性,根据编码氨基酸序列构建的分子进化树显示猪与牛的亲缘关系最近,与斑马鱼的关系最远。UBE2b基因在梅山公猪各组织中广泛表达,其中睾丸为高丰度表达。该基因在梅山猪睾丸中的表达随日龄增加呈显著上升趋势,与睾丸发育显著相关(r=0.82,P<0.01),推测UBE2b可能在梅山猪精子发育和性发育中起重要作用。     

利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区

斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列.本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret0026 79基因的表达,研究IncRNA基因Nondret0026 79在斑马鱼中的调控功能.首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、gR2、gR3、gR4、gR5和gR6.人工合成gRNA转录模板,体外转录为gRNA,与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中.PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39％.繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上.该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lncRNA功能提供了一个有效的基因编辑工具.     

睡美人转座子真核表达载体的构建及在猪胎儿成纤维细胞系中的表达验证

睡美人(sleeping beauty,SB)是Tc1/mariner转座子超家族的一员,为探索睡美人转座子与不同的转座酶搭配使用及与同种转座酶不同比例搭配使用时的转座效率,本实验构建了SB真核表达重组载体PT2-SV40-EGFP,通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测进行了猪胎儿成纤维细胞系(PEFs)转染条件优化研究.研究结果表明,不同转座酶与转座子按10∶1混合后细胞转染效率相似,但报告基因表达水平有较大差异,其中SB 100X转座酶与转座子混合后细胞的表达水平最高;转座子PT2-SV40-EGFP质粒和SB 100X转座酶质粒按不同比例混合转染细胞研究表明,细胞转染效率相似,但表达水平存在显著差异,其中1∶1组最高,约是5∶1组和10∶1组的50倍.本实验优化了睡美人转座子的转座条件为制备转基因动物深入研究提供参考.     

不同ESR基因型小梅山母猪生长期血清激素浓度变化的特点

本试验对ESR基因AA和BB两种基因型的小梅山母猪生长期内(30~150日龄)血清中E2、P4、GH、FSH和LH的浓度变化进行了研究。结果表明,生长期小梅山猪BB基因型E2和FSH浓度有高于AA型的趋势,在135日龄时显著高于AA型(P<0.05);AA型GH浓度均高于BB型,且在45~130日龄时差异显著(P<0.05),说明发生了ESR基因突变的小梅山猪,其E2、FSH及GH 3种激素的分泌量也发生了改变。这3种激素的协同作用不仅使小梅山母猪表现出发情早、繁殖性能高等性状,而且在一定程度上反映了BB型小梅山母猪产仔多的特性。     

苏姜猪POU1F1基因第3内含子MspI切片段多态性研究

采用PCR～RFLP技术分析了苏姜猪的POU1F1基因第3内含子MspI酶切片段多态性在猪群中的分布情况。结果表明：3个基因型CC、CD、DD在苏姜猪猪群中的频率分别为0．1333、0．2333、0．6333;C和D等位基因的频率分别为0．250和0．750;在苏姜猪猪群中该位点偏离哈代-温伯平衡状态（P〈0．05）。对该基因的特性分析表明：多态信息含量为0．3400;群体杂合度为0．3750。