1株H1N1亚型猪流感病毒的全基因组特征及其对小鼠的致病性

旨在了解河南省猪流感病毒的流行情况及其遗传进化和基因组特征。2018年4月，从河南省某一出现疑似流感症状猪群中采集鼻拭子样品150份用于分离病毒，对分离病毒的全基因组进行序列测定和分析。同时感染6周龄BALB/c小鼠，研究其对小鼠的致病性。结果显示，获得1株H1N1亚型病毒[命名为A/swine/Henan/NY20/2018（H1N1）]。遗传进化表明，其HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支，PB2、PB1、PA、NP和M基因属于2009甲型H1N1分支，NS基因属于经典H1N1分支。HA蛋白的裂解位点序列为PSIQSR↓GL，具有低致病性流感病毒的分子特征，在小鼠肺和鼻甲有效复制并能引起肺组织病理学变化。本研究分离到1株3源重排H1N1亚型病毒，对小鼠呈现一定致病力，提示应进一步加强对SIV的监测。     

3株鸽源新城疫病毒的分子特征及对鸽的致病性

2011―2013年在新城疫流行病学调查中分离到3株鸽源新城疫病毒(SDS,SD01和SD02),为了进一步了解其生物学特性和遗传进化规律,对3株病毒进行了测序和生物活性分析,并对分离株SDS对鸽的致病性进行了评价。结果表明,毒株SDS基因组全长为15192 bp,基因排列方式为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,3个分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列均为¹¹²RRQKRF¹¹⁷,具有典型的新城疫强毒的分子特征。系统进化分析表明这3个毒株与基因Ⅵ型NDV毒株聚于一簇,属于ClassⅡ系Ⅵb基因型。3个分离株F蛋白的融合肽和七肽重复区,HN蛋白的抗原中和表位存在多处突变,与单克隆抗体1E5、2F10的反应性也发生改变,表明3个分离株与疫苗株LaSota有明显的抗原差异。SDS攻毒试验结果显示,试验鸽自攻毒后5 d出现明显的临床症状,滴鼻组和肌肉注射组的死亡率分别为60%和70%;病死鸽剖检可见脑膜充血出血,腺胃乳头、腺胃肌胃交界及肠道出血,肝脏肿大,脾有淤血斑。滴鼻组在攻毒后5~14 d于喉头和泄殖腔检出排毒,而肌肉注射组在攻毒后3~14 d于喉头和泄殖腔有排毒。     

自噬调节剂对感染日本脑炎病毒小鼠脑部细胞凋亡的影响

旨在研究自噬调控药物对感染日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）小鼠脑部细胞凋亡的影响，本试验建立自噬调控药物处理的感染日本脑炎病毒小鼠的动物模型，其中，雷帕霉素为自噬诱导剂，渥漫青霉素及氯喹为自噬抑制剂。实验动物分成8组：DMEM对照组（Control）；JEV感染组（JEV）；JEV+雷帕霉素（Rapamycin）组（JEV+Rapa）；JEV+渥漫青霉素（Wortmannin）组（JEV+Wort）；JEV+氯喹（Chloroquine）组（JEV+CQ）；雷帕霉素组（Rapa）；渥漫青霉素组（Wort）；氯喹组（CQ）。观察不同处理组小鼠的临床症状；透射电镜观察小鼠脑部神经元及胶质细胞的线粒体损伤程度；Tunel染色观察统计小鼠脑部凋亡细胞分布；检测小鼠脑部凋亡因子及凋亡蛋白的表达量。与JEV+Rapa及JEV组相比较，JEV+Wort及JEV+CQ组小鼠出现轻微的神经症状，脑部神经元及胶质细胞线粒体轻度损伤，脑组织较少细胞发生凋亡。不同处理组小鼠脑部凋亡因子及凋亡蛋白的表达量变化差异不显著。综上表明，自噬抑制剂渥漫青霉素和氯喹可以在一定程度上抑制感染日本脑炎病毒小鼠脑组织中细胞凋亡的发生。     

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10¹~1.36×10⁸拷贝/μL线性关系良好,相关系数R²=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

一例麻鸡滑液囊支原体病的诊疗报告

鸡滑液囊支原体病是当今危害养鸡业的重要疾病之一,一旦感染,轻症瘫痪,重症死亡。控制本病的最佳方案是做好鸡场的消毒和净化,配以敏感药物进行治疗和预防。辽宁省宽甸满族自治县毛甸子镇某养鸡户饲养的2500只麻鸡饲养至58日龄出现以瘫痪、不愿吃食、羽毛蓬乱并逐渐消瘦为主要症状的病变,初期使用大肠杆菌及病毒类的药物进行治疗,效果不明显,后采集病料送吉林大学兽医学院传染病教研室做病原检查,确诊为鸡滑液囊支原体病。遵循“两个疗程,两种药物”的治疗原则,使病情得以控制,现报道如下。     

基于抗体筛查的美国猪群流行性腹泻病毒真流行率分布推断

养殖家畜的冠状病毒，如猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），其基因序列与蝙蝠体内冠状病毒基因序列高度相似，可引起猪肠道感染并导致仔猪大量死亡，对动物健康危害极大。本研究基于对美国猪群PEDV流行毒株表观流行率的数据挖掘作为先验信息，以2019年美国生猪入境中国西南陆路口岸的实验室抗体筛查为知识更新，利用贝叶斯统计推断方法，估计美国猪群PEDV发生的真流行率分布。结果显示，PEDV在美国猪群中的真流行率分布中位值（median）为0.005 22（95% CI=0.000 424~0.022 5），95%的高置信上限（upper confident limit，UCL）的流行率分布为3%。后验分布流行率高度右偏的概率密度统计特性推断美国猪群PEDV真流行率最大可能分布主要集中在2.5%百分位数（P_2.5%=0.000 2）与中位数（P_50%=0.005 22）之间，但不同生猪畜群间PEDV真流行率分布值可能会存在有小概率溢出分布大于0.03（P≤2.5%）的可能。此外，在现阶段口岸筛查的试剂选择方面，建议口岸首先使用基于N蛋白的ELISA抗体作为初筛，然后以基于S1重组蛋白ELISA抗体筛查作为复筛，来提高口岸对来自美国生猪的α-冠状病毒入境我国的风险认知、管控和鉴别能力。以先验分布和口岸实验室检测结果优化为基础的贝叶斯统计推断监测技术，可以为在现有知识和认知基础上最大程度阻断来自异域病原微生物入侵提供基于科学证据的风险决策技术支持，对口岸检验检疫、抽样监测和风险决策具有突破性的意义。     

神经介素B及其受体NMBR参与抗A型流感病毒H1N1亚型感染的信号通路

NMB/NMBR通过调节A型流感病毒（IAV/H1N1/PR8）感染诱导的细胞因子表达而参与抗IAV的先天性免疫反应。为探究其发挥抗IAV/H1N1感染的信号通路，本文用PR8和WSN毒株分别感染MLE-12细胞和小鼠，用NF-κB抑制剂BAY11-7028单独或联合NMB处理MLE-12细胞，小鼠后腿肌内注射NMB和NMBRA，采用RT-PCR和qRT-PCR分析NMB、NMBR、IL-6、IFN-α和NP基因表达变化，采用Western blot分析NMB、NMBR、P65/p-P65、IκBα和NP蛋白表达的变化。结果显示，BAY11-7028可促使PR8和WSN感染的MLE-12细胞中NMB、NMBR、IL-6和IFN-α基因表达水平均下降和NP基因表达水平上升，并降低NMB、NMBR和p-P65蛋白表达水平和提升IκBα和NP蛋白表达水平。然而，NMB联合BAY 11-7028诱导PR8或WSN感染后的细胞中IL-6和NP表达出现极显著下降和IFN-α显著上升。此外，NMB抑制PR8和WSN感染的小鼠肺组织内p-P65和NP蛋白表达水平和促进IκBα蛋白表达水平；NMBRA联合NMB抵消NMB对PR8或WSN感染后的这些蛋白表达水平的调节作用。综上表明，NMB/NMBR通过调节PR8和WSN感染的MLE-12细胞和小鼠体内的NF-κB信号通路上P65蛋白磷酸化和IκBα的表达，进而影响下游细胞因子IL-6和IFN-α基因的表达，从而发挥抗IAV/H1N1感染的先天性免疫应答反应。     

甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。