重组禽腺联病毒介导的溶菌酶对临床病原菌的抑制作用

在前期研究基础上,将经转座获得的杆状病毒重组穿梭质粒rBacmid-Rep、rBacmid-VP和rBacmid-LYZ共转染Sf9昆虫细胞,产生了表达人溶菌酶(hLYZ)的重组禽腺联病毒(rAAAV)(rAAAV-hLYZ);然后用纯化好的rAAAV-hLYZ溶液,在固体培养基上对常见病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、白色念珠菌进行体外抑菌活性试验,研究重组禽腺联病毒介导的溶菌酶对临床病原菌的抑制作用。结果表明,溶菌酶基因能在重组禽腺联病毒中高效表达,这为进一步探索溶菌酶作为新型兽用生物药物奠定了基础。     

泰州地区奶牛乳房炎主要致病菌的药敏试验及"乳乃康"体外抑菌试验

选用9类共14种药物对江苏泰州地区奶牛乳房炎主要致病菌进行药敏试验,采用牛津杯法和双倍试管稀释法对"乳乃康"的体外抑菌情况进行了观察.结果表明:头孢曲松钠和氯霉素类药物对葡萄球菌属致病菌表现出较好的抑菌效果,喹诺酮类、氯霉素类药物和复方新诺明对链球菌属致病菌表现出较好的抑菌效果,头孢曲松钠和喹诺酮类药物对大肠杆菌表现出较好的抑菌效果,对酵母菌各种抗生素均未有抑菌作用或抑菌作用不明显;"乳乃康"对葡萄球菌属、链球菌属、大肠杆菌、酵母菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为1 583.33、1 180、1 700、2 100 μg/mL,最低杀菌浓度(MBC)为2 033.33、1 633.33、2 000 μg/mL和无杀菌作用,对链球菌属病原菌表现出较好的抑菌杀菌效果.     

江苏地区6株猪圆环病毒2全基因的克隆与分析

根据已发表的猪圆环病毒2基因序列设计1对PCR引物,用PCR方法从6株PCV2江苏分离株(YZ60615,YZ60721,YZ70717,TZ60607,TZ60804、YC60711)中扩增出相应的全基因组DNA片段。按常规方法克隆,获得6个含有相应片段的重组质粒。序列测定结果表明,6株病毒的基因组大小均为1 767 nt,与GenBank中已发表序列同源性为94.6%~100.0%。遗传进化分析表明,这6株江苏地区的病毒与浙江株(AY678532,AY691169,AY510375)、福建株(DQ180393)、江苏株(DQ104422)亲缘关系较近,与多数中国分离株亲缘关系较近并形成较大的一簇,而与美国株(AF264041)、加拿大株(AF086836)遗传关系较远。     

猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性

旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2^-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×10⁸ IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2^-10.29,抗P...     

荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV接触感染仔猪增殖动态

为检测高致病性PRRSV接触感染仔猪的增殖动态,建立了荧光定量RT-PCR方法,该方法在模板为2.18×10~1~2.18×10~6拷贝范围内具有良好线性关系,相关系数为0.996,灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍,并且与其他猪病病毒无交叉反应;在3头健康仔猪中引入1头PRRSV人工感染猪,定期监测仔猪接触感染PRRSV后病毒血症和排毒水平,研究结果表明,接触感染猪后分别于3、5 d首次在血清和粪便中检出PRRSV,相比人工接种猪推迟2 d,此后7 d内病毒含量迅速上升并维持较高水平直至死亡。本研究为PRRSV在猪体内的定量检测提供了有效手段,为进一步了解PRRSV的传播机制以及建立防治PRRSV感染的仔猪模型提供了基础数据。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

猪圆环病毒2型的血清学检测

以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(His-CAP2)为抗原,通过方阵ELISA滴定,确定了His-CAP2的最适包被浓度为6.4μg·mL-1,待检血清稀释度为1:40,建立PCV2的血清流行病学的间接ELISA监测方法.通过对已知PCV2血清及其他病毒血清的试验,表明该ELISA方法具有良好的特异性.利用该方法对来自苏中地区不同猪场的175份血清样本进行检测,PCV2抗体阳性检出率为70.29%,与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况相符合,证实了此方法临床应用的可行性.     

3株HPI+大肠杆菌fyuA与int基因的检测及序列分析

在耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的基因中,fyuA编码鼠疫菌素受体与细菌的摄铁能力调节有关,int编码的整合酶与HPI在大肠杆菌基因组αsn-tRNA位点的整合相关.根据GenBank中已发表的HPI基因序列设计2对引物,分别用于fyuA和int的PCR扩增.将从3株仔猪腹泻源HPI+大肠杆菌(S70903株、S70925株、S70931株)中扩增的片段克隆至pGEM-Teasy载体,分别获得含有fyuA和int的重组质粒.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明:所克隆的fyuA基因大小均为948 bp,与已发表序列的同源性为98.6%～100%.所克隆的int基因片段大小均为1 391 bp,与已发表序列的同源件为96.0%～99.6%.研究结果提示,这3株细菌的fyuA基因并没有因为HPI的转移而缺失或被修饰,并且均整合在大肠杆菌基因组口αsn-tRNA位点.     

犬瘟热病毒基因免疫的探索

将15只经检测未感染犬瘟热病毒(CDV)且抗体阴性的3月龄普通犬随机分为2组,其中试验组10只,对照组5只.将CDV附着蛋白(H)重组质粒pcDNA-H和融合蛋白(F)重组质粒pcDNA-F混合后,以聚乙烯胺(PEI)作为免疫佐剂(各质粒终浓度均为200 μg·mL-1), 肌肉接种试验组动物;并以生理盐水接种对照组.病毒中和试验表明: 动物在首次免疫后抗CDV抗体中和价为10-0.78±0.14, 第2次免疫后为10-1.12±0.20, 第3次免疫后达到10-1.55±0.19.在试验组第3次免疫后28 d, 所有动物均接种CDV分离株YZ0101; 结果发现试验组动物均未出现典型的犬瘟热临床症状,且攻毒后第18天外周血淋巴细胞CDV检测为阴性,而对照组动物均出现典型的犬瘟热临床症状和组织病理变化,且攻毒后第18天外周血淋巴细胞中病毒RNA检测为阳性;这表明用所制备的重组质粒免疫动物对抵抗CDV感染具有保护作用.