利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体

为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/FuJian/01/02株感染性克隆构建

摘 要：1999-2002年本试验室从我国南方健康鸭体内分离到21株H5N1亚型禽流感病毒,对其进行系统地生物学特性和遗传演化分析发现,其中A/Duck/FuJian/01/02(简DKFJ)和A/Duck/Guangxi/53/02(简DKGX) 属于同一基因型, 对鸡都呈高致病性,但对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性明显不同: DKGX对小鼠呈低致病性（MLD50>106.5）,DKGX株反向基因操作系统本试验室已经建立,而DKFJ对小鼠呈高致病性（MLD50<100.5）。为了研究这两株病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠致病性差异的分子机制,本研究构建了对DKFJ的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染技术成功拯救了该病毒（R-DKFJ）。R-DKFJ在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性保持了与亲本野生毒（W-DKFJ, MLD50<100.5）一致的生物学特性,并且对小鼠呈全身感染,即106EID50鼻腔感染小鼠后第三天在脑、脾、肾、肺脏等脏器检测到病毒。DKFJ反向基因操作系统的成功建立为阐明H5N1亚型禽流感病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病机制等方面奠定了基础。     

禽流感HA基因疫苗脂质体的制备及其理化性质

用改良的逆相蒸发法制备了Ｈ７亚型禽流感保护性抗原血凝素（ＨＡ）基因重组质粒ｐＳＶＨ７脂质体。电镜观察表明,该脂质体多呈球形的单层或多层结构,脂质体粒径分布均匀,粒径范围２０～７００ｎｍ,平均粒径１６３ｎｍ,主要粒径分布位于５０～２００ｎｍ（８４．８０％）。重组质粒ＤＮＡ在脂质体的制备过程中保持了稳定性,并能抵抗ＤＮＡ酶的水解破坏作用。吸收光谱表明,在２４８ｎｍ及２６８ｎｍ处脂质体有２个特征吸收峰,ＤＮＡ的存在不改变吸收峰的位置,但能增加吸收峰的强度。     

H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

[目的]流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的,笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后,病毒对小鼠的致病性发生了改变.通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点,为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础.[方法]对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对,确认氨基酸...     

H6N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

为建立H6N6亚型禽流感病-毒(AIV) A/Chicken/GuangDong/S1311/10 (W-CKGD)反向遗传操作系统,本研究构建了W-CKGD的8个重组质粒,拯救出AIV A/Chicken/GuangDong/S1311/10 (R-CKGD).全基因序列测定结果表明,救获病毒R-CKGD与野生病毒W-CKGD的核苷酸序列完全相同.R-CKGD与W-CKGD具有相同的受体结合特性和对BALB/c小鼠均呈低致病性,以106 EID50剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒仅在小鼠的呼吸道复制,可以引起小鼠体重下降但均不造成死亡.实验结果表明,R-CKGD与W-CKGD保持了一致的生物学特性,从而为进一步研究H6亚型AIV的致病机理及跨宿主传播机制等提供了良好的平台.     

浅谈对荷兰等地高致病力禽流感的认识

自 2 0 0 3年 2月底 ,荷兰、比利时和德国相继爆发高致病性禽流感 (HPAI) ,不仅给本国的养禽业造成了巨大的经济损失 ,严重阻碍了本国的对外贸易 ,也给他国造成了巨大的威胁。中国是世界第一养禽大国 ,预防和控制HPAI对于促进养禽业持续、稳定、健康地发展有极为重要的意义。1　高致病性禽流感的危害巨大HPAI是能给养禽业带来毁灭性危害的I类烈性传染病。自 195 9年以来 ,全世界共爆发了 2 0次HPAI,其中 14次是在鸡群中爆发的 ,每次HPAI的爆发都造成了严重的损失。此次荷兰高致病性H7N7HPAI是危害最严重的一次禽流感大流行。这次…     

禽流感病毒A/Afri.Star/Eng-Q/983/79/(H7N1)血凝素基因的全序列分析

对反转录－聚合酶链反应扩增克隆的Ｈ７亚型禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）的血凝素（ＨＡ）基因进行了核苷酸序列分析。结果,克隆的ＨＡ基因共１７０７ｂｐ,包括完整的阅读框架;同源性分析表明该毒株起源于欧亚群系;ＨＡ裂解位点只有一个碱性氨基酸,显示典型的低致病力特征。Ｈ７亚型ＡＩＶＨＡ基因的克隆成功为分子诊断和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

兼顾H5亚型高致病性禽流感病毒不同分支HA蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立针对我国主要流行的H5亚型Clade7.2、Clade 2.3.2和Clade2.3.4.4分支高致病性禽流感病毒(HPAIV)不同流行株的免疫学快速检测方法,本研究将Clade7.2分支禽流感疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7)、Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(H5N1)(Re-10)混合作为免疫原免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫后无菌取其脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下融合,通过间接ELISA方法及HI试验筛选获得6株能稳定分泌抗血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能够与当前AIV流行的分支反应,具有较好的广谱性。本研究为H5亚型AIV快速诊断技术的研发提供基础材料。