农杆菌介导法将抗草甘膦基因EPSPS转入玉米自交系的研究

通过农杆菌介导法将抗草甘膦基因EPSPS转入玉米自交系H99中,同时研究了农杆菌浓度、侵染时间及共生培养条件等因素对转化频率的影响。结果表明:菌液浓度OD600为0.6、侵染时间20 min、共生培养时间3 d为最佳转化条件。获得的转基因植株经PCR分析鉴定,其中7株表现阳性,证明外源基因已经整合到玉米基因组中。     

转AtGA2ox1基因玉米自交系和杂交种的耐旱性分析

AtGA2ox1基因是调控赤霉素代谢的关键基因。以3个AtGA2ox1基因转化体回交转育玉米自交系和配制的杂交组合为研究材料,系统开展玉米自交系和杂交种的耐旱性分析。结果表明,3个转化体在回交转育过程中,多世代间遗传稳定。苗期不同转化体玉米在干旱胁迫24 d后复水仍能正常生长;对照材料胁迫后叶片卷曲至萎蔫,复水后无法恢复生长。通过对丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等生理生化指标的跟踪监测发现,干旱胁迫条件下转基因玉米的MDA含量低于对照约20%;超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性高于对照20%,降低玉米细胞膜氧化损伤来增强转基因玉米耐旱胁迫能力,与玉米耐旱表型一致。成熟期干旱条件下,对照玉米果穗变小,穗长变短,穗重减轻。转基因杂交种的粒重和百粒重显著高于对照,其中杂交种NKYGA09*X923-1百粒重高于对照杂交种21.21%,表现出潜在的育种价值。     

抗除草剂转基因玉米快速有效鉴定方法的建立

以含草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyl transferase gene,bar)为筛选标记的抗除草剂转基因玉米为研究材料,通过叶片喷雾法和叶片离体平板培养法试验,建立快速有效鉴定转基因玉米的方法,并探索可有效区分转化和非转化植株的筛选剂剂量。研究结果表明:这两种方法都能快速、有效、方便地鉴定抗除草剂转基因玉米;2000mg/L草铵膦叶片喷雾和培养基中含有5mg/L草铵膦叶片离体培养可快速有效区分是否转入bar基因。通过Bar试纸条分子检测法验证了该鉴定方法的准确性。该鉴定方法的建立为快速有效的筛选大量转基因材料节约大量时间和经费。本研究建立的鉴定方法在转基因材料鉴定和转基因安全评估中具有重要意义。     

转双价抗虫基因Bt-pta玉米植株的获得

以7922、8902、4112、340和853为受体材料,研究不同基因型的愈伤组织诱导与再生芽苗的关系,其中7922芽苗率为76.4%;8902、4112、340芽苗率分别为8.2%、12.7%和0%和11.8%,结果显示7922主要以体胚发生为主,芽苗率高,是遗传转化的良好受体材料。且胚性愈伤组织随着继代次数的增加变异率随之增加,应尽量减少继代次数以提高转化率。研究进一步利用PDS-100型基因枪将包含抗除草剂基因(bar)、苏云金杆菌毒蛋白基因(cryIA(a))和半夏凝集素基因(Pinelliaternataagglu-tinin,PTA)的聚合载体p3300-bt-pta导入7922的胚性愈伤组织,经PPT(3mg/L)筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株。从获得的28株再生植株中筛选获得22株具有除草剂抗性的植株,PCR分析表明有7株同时含有Bt、PTA、Bar三个基因,共整合的频率为31.8%,结果表明将多价抗性基因同时导入玉米获得多抗的转基因玉米材料是可行的,这为通过转基因聚合育种培育创造同时抗鳞翅目害虫和同翅目害虫的玉米品种奠定了基础。     

农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行 PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究

为了提高玉米自交系的遗传转化率,建立农杆菌介导玉米遗传转化体系。通过农杆菌菌株EHA105侵染玉米自交系7922的胚性愈伤组织,以β-葡萄糖苷酶基因(GUS)为报告基因研究几种因素对遗传转化体系的影响。结果表明：（1）当农杆菌浓度OD600=0.6时,GUS瞬时表达率最高为35.3%;（2）当侵染时间为15 min时,GUS瞬时表达率最高为37.3%;（3）当共培养时间为3天和恢复培养时间为4天时,GUS瞬时表达率最高为29.1%。因此选择农杆菌浓度OD600=0.6,侵染时间15 min,共培养3天和恢复培养4天,为最佳遗传转化条件。通过优化影响遗传转化体系的因素,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

转基因抗虫玉米Bt毒蛋白的时空表达分析

对2个转Bt基因玉米抗虫系株系进行Bt毒蛋白表达量的分析测定。结果显示,转基因株系中的毒蛋白可以在其后代稳定的遗传和表达,毒蛋白的表达为组成性表达,在玉米的各个发育时期和植株的各个部位均有表达,但其表达的量有显著差异,毒蛋白表达量随着植株的生长而减少,比较植株的各个器官,叶片毒蛋白含量最高,茎次之,根、种子和花丝中的毒蛋白含量较少。     

抗除草剂转基因玉米育种筛选方法的建立

本试验建立了一个以除草剂抗性为选择标记的玉米(Zea mays L.)转基因育种中的早期世代批量快速筛选技术.通过对玉米自交系铁7922、吉8902、丹340、PA91以及转Bar基因PA91玉米PA91TBA523在营养钵中浸灌250mg/L、500mg/L、1 000mg/L、1 500mg/L不同浓度的Basta除草剂的萌发试验,确立了不能正常生长的临界浓度:铁7922在250 mg/L的除草剂中无法生长,吉8902在500 mg/L的除草剂中无法生长;转基因材料PA91TBA523在除草剂达到1 500 mg/L仍与不浸灌除草剂的对照无明显差异.利用此方法对花粉管通道法转化获得的转基因T0植株的种子进行鉴定和筛选,从T0植株种子(T1)获得阳性植株6株,3株获得种子,对获得的种子(T2)再做除草剂筛选,抗性植株PCR检测均表现阳性.对以往的转基因T3做批量规模筛选,可以淘汰大量(70%)非转基因和表达不强的株系或个体,减少了田间种植工作量,提高了育种效率.     

农杆菌介导的玉米合子基因转化

本研究建立了农杆菌介导的玉米合子转化方法。用农杆菌介导合子转化方法,以含有bar基因的标准双元载体PTF102和含有bar基因和双价抗虫基因Cry1A（a）或Cry1A（c）、PTA（半夏凝集素）的载体p3300-Bt-pta转化玉米自交系吉8902、丹340、吉4112、吉853、铁7922及PA91,直接从受体植株得到转化种子,用除草剂PPT筛选和PCR鉴定,获得转基因植株及后代。实验分析了2002年、2003年和2004年的3批转化操作的结实率、转化率及转基因的遗传情况：经农杆菌侵染的雌穗平均结实率为39％,合子转化频率达1％以上,转基因可以遗传下去。农杆菌介导玉米合子转化方法可以重复获得成功,表明我们成功建立起一个新的不依赖组织培养的玉米转基因技术体系。     

玉米杂交种苗期耐盐碱筛选与大田鉴定的比较分析

基于所确定的玉米苗期耐盐碱筛选最宜浓度和适宜的生理生化指标,对14个吉林省主推玉米杂交种进行苗期盐碱耐性分析和大田鉴定。结果表明:大田鉴定结果与苗期耐盐碱能力综合评价分级基本吻合;苗期盐碱耐性弱的杂交种其大田减产明显,其减产率最高为44.12%,最低为17.39%,证明鉴定方法与评价指标科学有效,并可以初步筛选剔除一些苗期胁迫表现弱的材料;对于苗期胁迫耐盐碱能力综合评价表现较强的杂交种,其大田减产率变化幅度不大,变化范围在9.33%～11.76%,具体品种是否适宜盐碱地种植需经进一步的大田鉴定。