显微注射生长激素基因导入中国对虾（Penaeus chinensis）受精卵的研究

本实验采用显微微量注射方法，交羊生长激素基因导入中轻地虾受精卵，受精卵发育到蚤状幼体第三期后采样检测。ＰＣＲ检测结果表明：７个样品共９３尾幼体，有３个样品呈出阳性信号，基因转移比率至少在３％以上。同时斑点杂交结果也证明有两个明显阳性斑点。     

鲤鱼血淋巴细胞培养及染色体制备条件探索

从鲤鱼侧线鳞处静脉采血于含有肝素的一次性注射器中，采用RPMI1640全培养基进行体外淋巴细胞培养。通过对采血后细胞培养时间、秋水仙素浓度及加入时间、低渗时间及温度等条件的摸索，建立了较成熟的培养鱼类血淋巴细胞的实验方法。     

遗传和温度因素对鱼类性别分化相关基因表达及性别比例的影响

鱼类的性别决定机制较为复杂,是遗传和环境共同作用的结果,具有很大的可塑性。随着分子生物技术的不断更新,对鱼类性别决定及分化相关基因的鉴定和研究有了新的进展,环境因子如温度、光照、p H、低氧、水压等均能影响大多数鱼类的性别决定和分化过程。本研究中,阐述了鱼类遗传型性别决定(GSD)和温度依赖型性别决定(TSD)方式,并对TSD与遗传型性别加温度影响(GSD+TE)性别决定机制下,性别决定相关基因在雌雄异型中的表达及结合温度诱导性逆转进行概述,分析了温度对鱼类性别比例的影响,并提出今后应加强对性别决定基因的鉴定、解析和基因功能研究,为科学制定鱼类繁殖计划提供指导。     

碳酸盐碱度对达里湖瓦氏雅罗鱼耗氧率、氨氮排泄和排氨基因表达的影响

采用封闭流水式呼吸室法,研究了不同浓度碳酸盐碱度(以下简称CA,10、30、50、70、90、110 mmol/L)对体质量为(84.62±6.70)g的达里湖瓦氏雅罗鱼耗氧率、氨氮排泄率、血氨含量及排氨基因Rh家族(Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2)在鳃组织中表达量的影响。结果表明,随着碱度的升高,瓦氏雅罗鱼的耗氧率和排氨率均表现为先下降后上升的趋势,且都显著低于对照组(P0.05)。在CA90时,耗氧率和排氨率均达到最低值,表明CA90可能是达里湖瓦氏雅罗鱼所能承受的最大碱度胁迫。相反,随着碱度的升高,瓦氏雅罗鱼的血氨含量呈现先上升后下降的趋势,在CA90时达到峰值。然而在CA0~50时,瓦氏雅罗鱼血氨含量无显著差异(P0.05),表明达里湖瓦氏雅罗鱼进化出特殊的排氨机制,使其体内能够保持较低的氨氮含量以此规避氨中毒。定量PCR显示,参与氨转运的4种Rh基因在不同碱度处理组均有不同程度的上调表达;其中Rhcg1和Rhcg2在高碱度(CA110)最为显著(P0.05),表明Rhcg1和Rhcg2可能在达里湖瓦氏雅罗鱼高碱胁迫下的排氨过程中发挥重要作用。能量代谢研究(O∶N)发现,在CA0~70时,雅罗鱼无需消耗过多能源物质即可实现高碱度胁迫下的能量需求;而在碱度为90~110时,则主要消耗脂肪和碳水化合物供能,减少蛋白质耗能,以此降低毒氨的产生。依据上述研究结果,深入探讨了达里湖瓦氏雅罗鱼在高碱胁迫下的排氨策略及其可能的生理和分子机制,为推动达里湖瓦氏雅罗鱼在不同类型盐碱水域的增养殖提供科学依据。     

氯化钠盐度和碳酸氢钠碱度对达里湖鲫毒性影响的初步研究

对达里湖鲫Carassius auratus Linnaeus 3月龄幼鱼(体长为4.16 cm±0.47 cm)分别在不同浓度梯度下进行盐度和碱度急性胁迫试验,分析盐度、碱度以及盐碱混合对达里湖鲫的毒性影响,并在此基础上采用水生态毒理联合效应相加指数法进行了氯化钠(NaCl)和碳酸氢钠(NaH-CO3)浓度的联合毒性试验,探讨了在不同类型盐碱水质条件下开展增养殖活动的可行性.结果表明:在pH为7.0±0.5,碱度为0.44mmol/L时,盐度对试验鱼的24、48、72、96 h的半致死浓度(LC50)分别为11.57、11.14、10.89、10.61,安全值(SC)为3.10;在pH为8.5±-0.5,盐度为1.9 ～4.3时,碱度对试验鱼的24、48、72、96 h的LC50分别为71.93、67.80、65.80、63.42 mmol/L,SC为18.07 mmol/L;在96 h内NaCl和NaHCO3的关系全部为拮抗作用,且其拮抗效应逐渐减弱并趋向于相加作用.本试验结果可为今后在内陆盐碱水域开展达里湖鲫增养殖提供科学依据.     

不同盐度、碱度、pH值对瓦氏雅罗鱼精子活力及其受精率的影响

为了掌握瓦氏雅罗鱼精子活力及其受精率的最适盐度、碱度和pH的范围,通过设置不同NaCl盐度(1‰,2‰,3‰,4‰,5‰,6‰,7‰,8‰)、NaHCO3碱度(10,20,30,40,50,60,70 mmol/L)、pH值(5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0)梯度范围的溶液及淡水对照组(盐度0、碱度0、pH值6.67)激发达里诺尔湖瓦氏雅罗鱼精子活力,观察了不同处理组精子状态,并对其激烈运动时间、快速运动时间及寿命进行了测定,同时测定了受精卵在不同盐度、碱度和pH溶液中的受精率.结果表明:盐度在0～4‰,瓦氏雅罗鱼精子激烈运动、快速运动时间及寿命呈逐渐上升趋势,4‰达到最长;碱度在0～50 mmol/L,精子激烈运动、快速运动时间及寿命随碱度增加而延长,50 mmol/L达到最大;pH值5.0～7.0,精子激烈运动、快速运动时间及寿命随pH值的升高而延长,pH值7.0达到最大;受精率分别在盐度4‰、碱度30 mmol/L、pH值6.5达到最高,不同盐度和碱度组的受精率显著低于淡水对照组.综上,基于对不同盐度、碱度和pH值对瓦氏雅罗鱼精子活力及其受精率的分析结果,建议在开展瓦氏雅罗鱼全人工繁殖及杂交育种过程中,尽量选择盐度在0～4‰,碱度为0～30 mmol/L,pH值6.0～7.0的盐碱水体或淡水中进行,可以获得较高的受精率及苗种成活率.     

瓦氏雅罗鱼耐碱性状相关分子标记的筛选

本研究以来自达里湖(碱水)和松花江(淡水)的瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)杂交F2为实验材料,通过碱度耐受实验进行性状测定,以39对多态的EST-SSR和SSR为标记,对77个F2个体进行基因分型,根据Fisher确切概率法对F2基因型和耐碱性状进行关联分析。结果发现,有2个标记与耐碱性状显著相关(P0.05),其中1个标记为EST-SSR,从瓦氏雅罗鱼转录组数据库中调取该EST序列,基因注释结果显示该序列与团头鲂(Megalobrama amblycephala)低氧诱导因子HIF-3?基因、草鱼的低氧诱导因子HIF-4?基因具有很高的同源性。该基因的主要功能是参与鱼类的耐低氧反应过程,加强鱼类的耐低氧能力。本研究对于今后深入研究此功能基因的作用机制及培育适于盐碱水域养殖的鱼类新品种具有重要的意义。     

鲤脑组织cDNA文库的构建及鉴定

用Gubler—Hoffman法构建了耐低温鲤Cyprinuscarpio脑组织全长cDNA文库,经测定库容量为5．7×10^5cfu／mL,文库的重组率接近95％,平均插入片段长度为1500bp,符合文库保存和筛选实验的要求。同时,根据鲤与低温相关的消减eDNA文库中低温下特异表达基因的片段序列,设计了PCR引物,并在此eDNA文库中进行PCR检测和序列测定。使用BLAST软件将测序的10个cDNA序列同GenBank等数据库进行比对,结果显示,8个阳性克隆有相关同源性,2个克隆为功能未知的基因,全长率接近75％。     

中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库.并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DHSα大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12:探针进行第二次筛选.结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5%;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8%.经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列.在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元.根据侧翼序列没计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,15对具有多态性.本研究对中华绒螯蟹基因组资源的开发利用提供了相关资料.