马铃薯蛋白酶抑制子StPI基因的克隆及表达分析

 【目的】克隆马铃薯蛋白酶抑制子基因StPI的全长cDNA。【方法】以马铃薯高抗青枯病二倍体基因型ED13为材料，采用RACE方法进行StPI基因全长cDNA的克隆，利用半定量RT-PCR方法进行该基因的诱导表达分析。【结果】获得了StPI基因的全长cDNA，序列分析表明：该基因具有完整的开放阅读框架，编码116个氨基酸，与马铃薯蛋白酶抑制子 I 前体具有较高的同源性（核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89%和74%）。该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节，在6～12 h内即达到最高表达水平，但二者又有明显不同。相对而言，StPI基因受青枯病菌的诱导较弱，而受茉莉酸（JA）的诱导较为强烈，在JA处理3 h表达量即明显升高，6～12 h迅速升至最高。【结论】本研究从马铃薯抗青枯病基因型ED13中获得了StPI基因的全长cDNA。该基因可能参与了马铃薯的抗青枯病反应，且病菌处理对该基因的诱导可能与JA刺激具有相似或相同的信号途径。     

坛紫菜DNA的提取与快速纯化(简报)

由于藻胶(多糖) 的干扰,紫菜DNA 的提取、纯化非常困难. Kitade 等( 1996)曾建立了一个提取条斑紫菜高纯度DNA的程序,其中包括液氮破碎、CsCl密度梯度离心及CTAB处理等复杂的步骤,不是一个简便的常规方法.本研究以中国特有的坛紫菜为材料,拟建立其简便可靠的DNA提取与纯化方法,以获得高纯度紫菜DNA,为进行紫菜RFLP及AFLP等研究打下基础.     

利用RNAi技术抑制马铃薯类受体激酶基因(StRLK)表达的研究

植物类受体蛋白激酶(Receptor-like protein kinase,RLK)是蛋白激酶的一个亚家族,参与植物的信号转导,在植物生长发育、抗病等过程中起重要作用。在前期研究中自二倍体马铃薯高抗青枯病基因型ED13中获得了类受体蛋白激酶基因StRLK。利用StRLK基因的特异区段,以pUCCRNAi为中间克隆载体、pCHF1为植物表达载体,构建了该基因的RNA干扰载体pCHF1-StRLK。进一步以ED13的茎段为外植体,利用农杆菌介导法将pCHF1-StRLK导入ED13中,获得了5株再生植株。用CaMV35S启动子特异引物对5株再生植株进行PCR扩增,均得到大小约500 bp的特异性条带,初步证明pCHF1-StRLK成功转入ED13。以ED13为对照,利用StRLK基因的特异引物对这5株再生植株进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因的表达在5个转基因植株中均受到了不同程度的抑制,说明导入的pCHF1-StRLK发挥了干扰活性,且干扰效果与基因的插入位点有关,为进一步研究StRLK基因的功能提供依据。     

马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR扩增

根据马铃薯卷叶病毒CP基因的序列设计合成了两对特异性DNA引物,用RNA提取试剂RNAplant从感病的马铃薯叶片中提取总RNA,在3′引物引导下以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR,分别扩增出了长627 bp和336 bp的特异性PCR产物,其大小与预期的CP基因及其部分序列一致,实现了马铃薯卷叶病毒CP基因及其片段的简便、有效的RT-PCR扩增。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒s(PVS)总RNA为模板，通过RT—PCR获取长度为890 bp的P 一cp的cDNA，克隆至pGEM—T载体上。酶切回收该基因片段，并构建了该基因的原核表达质粒pBV—pvs。SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析表明：P 一印基因在大肠杆菌JM109中可特异地高效表达分子量约33kD的蛋白，且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔，获得的抗血清可用于大田马铃薯s病毒的快速检测。     

马铃薯脱毒小薯雾培结薯特点及增产效果

 采用草炭+ 蛭石双层基质无土栽培和自动控制槽式喷雾栽培两种模式进行马铃薯脱毒小薯结薯数量及小薯质量分布比较, 同期定植, 结果表明70 d 生长期内前者每株匍匐茎数量为15 条, 膨大成薯5. 7 个, 后者匍匐茎数量为97 条, 膨大成薯76 个, 分别是前者的6. 5 倍和13. 3 倍。槽式雾培较基质无土栽培可显著提高脱毒小薯的繁殖系数。     

马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。     

超表达StCYS1对马铃薯生长发育及酶促褐变的影响

为了探究半胱氨酸蛋白酶抑制子基因StCYS1对马铃薯植株生长发育及块茎酶促褐变的影响,本研究以超表达StCYS1和野生型二倍体马铃薯‘MDS’植株为材料,对植株光合指标、根系发育、产量及块茎褐变情况、PPO活性、总抗氧化能力和游离氨基酸含量进行测定。本研究发现,与野生型马铃薯植株相比,超表达株系的光合能力显著提高,根系更加发达,产量更高。与野生型相比,超表达株系块茎的酶促褐变减轻,PPO活性升高,游离脯氨酸含量和总抗氧化能力显著提高,游离酪氨酸含量下降。试验结果表明,超表达StCYS1株系显著提高了马铃薯植株的光合作用,促进了根系和植株发育,进而提高了马铃薯块茎的产量,超表达StCYS1有效提高了马铃薯块茎的抗氧化能力,降低了游离酪氨酸含量,显著抑制了马铃薯的酶促褐变。     

应用GAR-HRP进行甘薯病毒NCM-ELISA检测试验

分别采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 (GAR -HRP)和碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔抗体(GAR -AP) ,对甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)、甘薯潜隐病毒 (SPLV)、甘薯轻斑驳病毒 (SPMMV)及甘薯褪绿病毒(SPCFV)进行NCM -ELISA检测 ,结果表明 ,采用GAR -HRP进行NCM -ELISA检测对于SPFMV、SPLV、SPM MV、SPCFV同样有效 ,且特异性高 ,重现性好 ,在某些方面优于GAR -AP。对于国内危害甘薯的SPFMV、SPLV等主要病毒 ,采用GAR -HRP进行ELISA检测更加经济有效 ,是切实可行的     

马铃薯青枯病研究进展

青枯病(Bacterial Wilt)是由Ralstonia solanacearum引起的世界范围内的植物细菌性病害,可侵害马铃薯等数百种植物.Ralstonia solanacearum是一种土传性的微管束病原菌,可通过土壤、灌溉、植株、种薯等进行传播,寄主范围广,并随着气候变化、土壤类型、地理位置和耕作方式的不同而变化,造成不同程度的减产,严重者可使马铃薯减产80%,甚至绝产.由于该病的寄主不断增加,防治技术有限,该病已成为目前许多栽培植物的重大病害.