高盐极端环境土壤基因组DNA的分离纯化方法研究及基因文库的构建

以钦州市犀牛角镇晒盐池内(盐浓度>25%)的土壤样品为研究对象,对土壤混合基因组DNA的提取和纯化方法进行了深入研究,结果表明,冻融法、十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K联合使用的提取法,能有效提高DNA得率,DNA的产量达到每克土壤样品10~15μg。交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、Sephadex G-200树脂以及大量胶回收的使用,可有效纯化DNA,纯化的DNA产量可达每克土壤样品4~6μg,DNA片段大小>30 kb。将纯化的DNA用B amHⅠ部分酶切后构建以pLAFR 3为载体的混合基因组文库,该文库包含15 600个克隆,外源片段DNA平均大小为18 kb。通过DNA序列测定和同源性比较,对从文库中随机挑取的10个克隆进行了序列分析,发现9个外源插入片段包含未知DNA序列。     

高质量龙眼DNA快速抽提技术

龙眼树(Dimocarpus longana Lam.)组织含有大量的酚类、单宁等,DNA抽提纯化非常困难,常规方法提取的DNA往往严重褐变,杂质含量高,不适于作PCR模板;通过氯化铯密度梯度离心或柱层析作进一步纯化,费用昂贵,操作繁琐,不适用于一般实验室.本实验试用了多种抽提方法,发现SiO2微粒吸附法可快速简便地获取高质量的龙眼DNA.     

LiCl沉淀法提取富含荚膜的细菌基因组DNA

结合提取基因组DNA的CTAB法(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)和用于提取海藻基因组DNA的LiCl法,设计了针对产生较多荚膜多糖细菌的DNA提取方法—LiCl沉淀法。通过电泳、分光光度计及16SrRNA基因扩增检测,证明LiCl沉淀法可以有效地提取产荚膜细菌基因组DNA,其片断大小约为23kb,不需进一步纯化即可用于后续分子生物学实验。     

甘蔗基因组DNA简单和快速提取方法

目前国内外关于提取DNA的方法很多(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，但因研究的对象和目的不同而有所差异。甘蔗含有大量的酚和多糖等有机物质，由于这些物质的干扰，按照常规提取植物组织总DNA的方法提取甘蔗基因组DNA，常常因产量小和纯度低而不能满足实验要求。本实验在前人研究的基础上(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，对所用药品及技术进行改进，摸索出一套快速、简便且可获得高质量基因组DNA的改良方法。用此方法提取的DNA进行酶切、RAPD和Southem杂交分析，都取得了良好的效果。     

烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用

为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中,通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白.用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清.DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacumL.)样品及传播介体的检测.本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件.     

川白芷内源激素的提取纯化和高效液相色谱法同步测定

为探讨川白芷不同器官内源激素的提取纯化和分析测定,在前人研究的基础上,建立了一种从川白芷不同器官组织中快速提取纯化并同步测定4种植物内源激素(玉米素、赤霉素、3-吲哚乙酸和脱落酸)的高效液相色谱分析方法.样品经80％甲醇提取后低温浓缩,最后用甲醇定容.采用Tigerkin C18柱(150mm ×4.6mm,5μm)以甲醇-0.6％乙酸(50:50)为流动相进行高效液相色谱分离,PDA光电二极管阵列检测器检测,采用峰面积外标法(ESTD)进行定量.结果表明,该方法具有简单快捷,准确灵敏等优点,适合对川白芷内源激素进行快速同步测定.     

一种可用于PCR扩增的直接提取土壤细菌DNA的方法

本文以澳大利亚桉树林和松树林的土壤为例 ,采用Napp提取液和SDS直接溶解土壤细菌 ,并配合温浴 -玻璃珠震荡、苯酚 -氯仿萃取和异丙醇提取以及纯化DNA等步骤 ,直接从土壤样品中提取了土壤细菌DNA。所得DNA完全适用于酶解和PCR扩增的要求。该方法高效简单 ,费用低 ,在土壤微生物研究中具有重要的应用价值     

山羊c-Myc原癌基因克隆、原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化

本研究的目的是通过分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得山羊GST-Sox2融合蛋白.用RT-PCR方法从山羊(Capra hircus)肠组织克隆了c-Myc基因,通过TA克隆,构建了pMD18-T-Myc质粒.DNA测序证明,山羊c-Myc全长cDNA约1320 bp,该序列包含一个完整的开放阅读框,编码439个氨基酸,经分析该序列与绵羊(Ovis aries)的c-Myc序列同源性为99.2%.将该cDNA片段亚克隆至pGEX-KG载体,构建了重组质粒pGEX-KG-Myc.经酶切鉴定和测序,将重组质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,由IPTG诱导表达,以谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化GST-Myc融合蛋白.SDS-PAGE分析表明,纯化的GST-Myc融合蛋白约75 kD,与预期值相符,且呈现清晰的单一条带.Western blot检测证实,该融合蛋白能够被GST抗体所识别.本实验克隆了山羊c-Myc基因,获得了高纯度的GST-Myc融合蛋白,为其多克隆或单克隆抗体的制备提供了基础资料,为山羊iPS细胞(induced pluripotent stem cells)检测创造了条件.     

重组E2蛋白-乳胶凝集试验检测猪瘟病毒血清抗体

人工合成4条两两互补的DNA序列,经磷酸化和退火后与经BglⅡ酶切的pET-E2载体连接,得到pET-E2HA重组质粒.该质粒除表达E2蛋白A/D抗原区外,还表达3个串联的人流感病毒(Human influeoza virus)血凝素表位.重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),用IPTG诱导表达.利用纯化后的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断猪瘟抗体水平的乳胶凝集试验.利用盐酸胍溶解包涵体并过His·Bind柱,获得纯化的重组蛋白.研究结果表明,乳胶凝集方法具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于猪瘟病毒(Classical swinefever virus,CSFV)血清抗体检测的新方法.     

交替双频逆流超声辅助提取条斑紫菜蛋白和多糖

为了高值化利用条斑紫菜资源,该文采用交替双频逆流超声辅助提取技术生产条斑紫菜蛋白和多糖混合产品。研究了复合双频和交替双频2种超声模式对条斑紫菜蛋白和多糖提取效果的影响,采用中心组合设计响应面优化试验进行工艺优化。结果显示,交替双频超声模式显著优于复合双频超声模式。料液比、提取时间和温度均对提取效果影响显著。确定的交替双频逆流超声辅助提取的最优条件为:料液比14mg/mL、时间88min、温度41℃、pH值9.0、15和20kHz交替双频超声、超声交替工作时间3s、超声功率200W/L。在此最优条件下,条斑紫菜蛋白和多糖混合产品的生产能力最高,单位质量原料生产出的产品得率为(48.180.08)%,其中蛋白得率为(24.350.07)%,纯度为(45.610.33)%,多糖得率为(23.830.02)%,纯度为(44.640.37)%,比传统提取方法,得率提高了168%,时间缩短了64%;比单频逆流超声辅助提取方法,得率提高了50%,时间缩短了18%。从生产成本分析,交替双频逆流超声辅助提取方法具有明显技术优势和工业推广价值。