湖北和广西辣椒脉斑驳病毒的检测及 遗传多样性分析

[目的]研究辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)的分布及遗传变异,为明确该病毒在我国的流行扩散分子机制提供理论依据.[方法]利用特异性引物反转录PCR(RT-PCR)检测从湖北宜昌及广西南宁和百色采集的48份疑似感染PVMV的辣椒样本;采用常规Sanger测序测定PCR产物序列,序列采用MEGA 5.0构建系统发育进化树,采用RDP等算法分析其可能的重组事件;采用DnaSP v5分析病毒株系不同群体之间的基因流及基因差异.[结果]从48份辣椒样本中检测到5份样本被PVMV侵染,检出率10.42%.基因同源性比对分析结果表明,测定的PVMV湖北和广西分离物CP基因序列同源性在97.00%以上,与其他地区分离物的同源性为91.73%~98.78%.系统发育分析表明,湖北(YC)和广西(NN)PVMV分离物与我国台湾PVMV分离物的亲缘关系最近.重组分析表明,PVMV广西分离物NN10有2个重组事件.[结论]湖北和广西辣椒的PVMV检测结果表明,该病毒已扩散至湖北和广西;基因突变可能是PVMV湖北分离物遗传变异的主要方式之一;而基因重组和基因突变可能是PVMV广西分离物遗传变异的重要因子.     

万载龙牙百合主要病毒的检测及其检测技术的建立

采用RT-PCR法,检测了万载龙牙百合的主要病毒;通过RT-PCR反应条件的确定,建立了万载龙牙百合主要病毒的RT-PCR检测技术。结果表明:万载龙牙百合感染了百合斑驳病毒,没有感染黄瓜花叶病毒和百合无症病毒;百合斑驳病毒的RT-PCR检测技术为:50℃逆转录30 min;94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃最后延伸7 min。     

青虾源维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10-2 ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。     

西番莲TeMV和CMV双重RT-PCR检测体系的建立及应用

【目的】建立西番莲夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的双重RT-PCR检测体系。【方法】根据TeMV和CMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因序列,分别设计两对特异性引物,并对引物组合浓度、退火温度和循环次数进行优化。【结果】优化结果显示:TeMV和CMV最佳引物组合浓度分别为2.0 mmol·L~(-1)和8.0 mmol·L~(-1);最佳退火温度为57℃;最佳循环次数为35次。【结论】灵敏度分析结果显示,在样品c DNA原液稀释到10-5时,仍能检测到两种病毒扩增出的目的条带。同时,以健康组培苗作为对照组,应用建立的双重RT-PCR检测技术对采集于福建省不同产地的36份西番莲样品进行了病毒检测,发现有8份样品同时感染两种病毒,8份样品仅感染TeMV,10份样品仅感染CMV。本研究可为西番莲TeMV和CMV的检测提供便利。     

沙型盐碱地水产养殖生态修复效果评价

为修复西北地区沙型盐碱地的土壤环境，提升盐碱土地的利用效率，以景泰县盐碱地区为试验区域，创新采用水产养殖生态修复技术，并综合评价了该技术的修复效果。结果表明：采用水产养殖生态修复技术后盐碱地区的盐度，氯化物和硫酸盐等指标呈现逐渐下降趋势，改善了当地的土壤环境，提升了盐碱土地的利用效率。发展水产养殖业也给养殖户带来了一定的经济收益，提升了养殖户发展水产养殖业的积极性，起到了良性发展的效果。本文为盐碱土地的修复治理提供一种高效生态的修复方法，并为全国盐碱地的改良提供一定的技术参考。     

盛夏一次大暴雨过程成因分析

利用常规高空、地面观测资料以及FY-2E卫星云图等资料,对2017年8月19—20日发生在陕西省商南县青山镇的大暴雨天气过程进行综合分析。结果表明,东路冷空气和副高是此次暴雨的主要影响系统;副高外围的西南暖湿气流、西南涡东北侧切变后西北干冷气流和山东半岛低涡后东路回流湿冷气流这3股气流在商洛上空的交汇,为此次大暴雨过程提供了充沛的水汽和能量;暴雨区上空垂直运动发展旺盛且深厚,为大暴雨提供了抬升条件;高空急流右侧的强辐散为大暴雨上升运动和深对流形成提供了重要条件。双重辐合-辐散产生的强烈上升运动,抽吸作用明显,为深对流的发展提供了条件,也促进了大暴雨区附近小尺度系统的产生和维持。喇叭口地形触发了γ尺度对流云团的生成和发展,3个γ尺度对流系统的发展,造成2次强降水叠加形成此次大暴雨天气过程。     

塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RT-PCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在10~1～10~7拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。     

塞内卡谷病毒和口蹄疫病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立塞内卡谷病毒(SVV)和口蹄疫病毒(FMDV)的快速鉴别检测方法,本试验根据SVV 3D基因序列和FMDV 3D基因序列,分别设计探针和引物,建立了可同时检测SVV和FMDV的双重荧光RT-PCR法。结果表明,该方法特异性强,能准确检测出SVV核酸和FMDV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)等病原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测到SVV和FMDV核酸质量浓度分别为1.35×10~(-5),1.68×10~(-5) mg/L。重复性好,Ct值变异系数小于4%。利用所建立方法对116份已知的临床样品进行检测,结果与参比方法一致。本试验建立的方法可用于SVV和FMDV的鉴别检测,为塞内卡病毒病和口蹄疫的诊断提供依据。     

兔病毒性出血症快速检测方法的建立

兔病毒性出血症是兔的1种传播性极强、致死率极高的重要传染病,针对性地加强该病原的进出境监测将对动物疫病防控具有重要的意义。本研究使用软件分析设计RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR的引物和TaqMan探针,建立了兔病毒性出血症RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法,并测定其特异性和敏感性。试验结果显示,只有阳性参照样品的DNA出现扩增,其他对照样品均未见扩增产物,证实这些检测方法具有良好的特异性。对阳性样品DNA进行10倍梯度稀释,再分别用新建的2种方法进行试验,结果显示兔病毒性出血症RT-PCR检测的DNA下限量为100 pg,实时荧光定量RT-PCR的DNA下限量为100 fg,2种方法都具有较高的敏感性。新建的RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法互补应用,有助于缩短检疫周期、提高检测效率,为出入境口岸部门加强入境试验兔或其他不同用途兔的疫病检测提供技术保障。