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小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV,与其他4种病毒(菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus)不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。 相似文献
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偷死野田村病毒(CMNV)引起的病毒性偷死病(VCMD)使中国对虾养殖业遭受了严重的经济损失,为查明CMNV及其变异株的分子流行病学特征,本研究采用逆转录套式PCR (RT-nPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)和TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan RT-qPCR) 3种方法,对2016~2017年中国沿海省市CMNV及一种新型野田村病毒——行动障碍野田村病毒(MDNV)的流行、分布和变异情况进行了分析。结果显示,养殖凡纳滨对虾、中国明对虾、日本囊对虾、斑节对虾和罗氏沼虾等种类中均可检测到CMNV阳性;在河北、山东、浙江、福建、广东和海南等省市采集的患病对虾中均存在CMNV。基于RT-nPCR、RT-LAMP和TaqMan RT-qPCR的检测结果显示,2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率依次分别为11.8%和7.8%,6.7%和3.9%,17.7%和12.4%;基于上述3种方法检测结果计算得出,2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率分别为26.8%和16.3%;基于RT-LAMP的分析显示,2016年样品中MDNV的阳性检出率为9.4%。本研究表明,中国沿海省市养殖虾类中VCMD的流行和危害仍不容忽视,RNA依赖的RNA聚合酶基因不断变异导致前期基于该基因开发的CMNV检测方法可靠性下降,检出假阴性风险升高;同时,发病对虾中出现了新的野田村病毒株系且具有较高的流行率,其传播危害风险值得高度关注。 相似文献
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沙地葡萄茎痘相关病毒的RT-LAMP检测方法 总被引:2,自引:0,他引:2
本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus, GRSPaV)的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列(GenBank登录号:GQ478314)为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并确定了适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行Hha Ⅰ酶切,酶切片段与理论片段大小一致,证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10-4,与RT-PCR方法相比更为灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ (×1000)可直接观察反应结果。建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。 相似文献
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水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 总被引:4,自引:3,他引:1
【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-PCR灵敏性基本一致。检测结果易于判定。【结论】RT-LAMP检测方法适合寄主植物和介体体内RBSDV的快速检测。 相似文献
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逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒 总被引:3,自引:0,他引:3
根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。 相似文献
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牛轮状病毒三种核酸检测方法的比较 总被引:1,自引:0,他引:1
利用针对牛轮状病毒(BRV)的普通PCR、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)三种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行检测,比较三种核酸检测方法的检出结果。三种核酸检测方法中LAMP最敏感敏感,能检测到1拷贝/μL,Real-time PCR能检测到100拷贝/μL,普通PCR只能检测到1×104拷贝/μL。但结合临床样品检测表明:常规PCR方法敏感度低会造成一部分漏检,LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较三种方法后,推荐用LAMP结合real-time PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛轮状病毒的检出率。 相似文献