乳酸杆菌的分离、鉴定及体外拮抗试验

本研究利用不同配方的培养基选择性分离、纯化不同生长营养需求的菌种,然后对所分离菌株作形态观察、生理生化鉴定,再用牛津杯法进行乳酸杆菌全菌液与上清液对大肠杆菌拮抗作用的对比试验。结果分别从鸡粪、牛粪、猪粪中分离、纯化出发酵乳杆菌、发状乳杆菌、木糖乳杆菌;乳酸杆菌培养上清液的拮抗作用大于全菌液;鸡源发酵乳杆菌对猪源大肠杆菌有较好的生物拮抗作用;猪源木糖乳杆菌及牛源发状乳杆菌对猪源大肠杆菌无生物拮抗作用。     

Comparison of the immune responses induced by oral immunization of mice with Lactobacillus casei-expressing porcine parvovirus VP2 and VP2 fused to Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit protein

The major structural protein VP2 of porcine parvovirus (PPV) was used as the model parvovirus antigen, which has been expressed in Lactobacillus casei fusing with Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) as mucosal adjuvant. The VP2-LTB DNA fragment was cloned into vector pPG611 or pPG612 to generated inducible surface-displayed and secretion expression systems based on xylose promoter, designated as rLc:pPG611-VP2-LTB (recombinant L. casei) and rLc:pPG612-VP2-LTB, respectively. Expression of the fusion protein was verified by SDS-PAGE, Western blot immunofluorescence and electron microscopy. It was observed that the level of IgG or sIgA from mice orally immunized with VP2-LTB was higher than that from mice received VP2 and negative control, which demonstrated significantly statistically different. Especially, the titer of IgG or sIgA in mice immunized with rLc:pPG612-VP2-LTB is the highest in this study. In summary, LTB as mucosal adjuvant was able to effectively facilitate induction of mucosal and systemic immunity by L. casei-expressing VP2 fusion protein.     

猪源乳酸杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

乳酸杆菌制剂可以替代抗生素,用于预防和治疗细菌性腹泻。为获取可作为微生态制剂的候选菌株,从健康仔猪肠道分离到5株乳酸杆菌,经抑菌试验、生长曲线测定、耐酸、耐胆盐、耐胰酶试验等,筛选到1株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌有较好的抑制作用,对低pH值、高胆盐、胰酶均有一定耐受能力的乳酸杆菌,命名为LY7。经PCR鉴定,该菌株为约氏乳杆菌。     

不同乳酸菌对羊酸奶的感官和质构特性的影响

研究分析不同乳酸菌对羊酸奶感官与质构特性的影响作用,为筛选优良的羊酸奶发酵剂提供依据。使用双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、丁二酮乳链球菌发酵羊奶,对羊酸奶的感官品质、酸度及质构特性进行评定。结果表明,单一菌种发酵,四种菌发酵的羊酸奶的感官评分排序是双歧杆菌〉嗜热链球菌〉保加利亚乳杆菌〉丁二酮乳链球菌,不同乳酸菌发酵羊酸奶的质构特性差异显著,使用双歧杆菌发酵可以获得最佳的质构特性,其发酵的羊酸奶的硬度为34.96g、黏度为802.28g.s、凝聚性为44.65g、粘性指数为137.17g.s、保水力为85.00%;混合发酵剂发酵羊酸奶具有各自不同的感官和质构特性优势,双歧杆菌和嗜热链球菌发酵的羊酸奶的硬度和黏度最好,分别达到29.93g和715.09g.s,但风味欠佳;双歧杆菌和丁二酮乳链球菌发酵的羊酸奶的凝聚性、粘性指数和保水力最好,分别达到45.86g、143.49g.s、91.00%,且风味良好。综合感官评价与质构特性,复合菌种双歧杆菌和丁二酮乳链球菌适宜作为羊酸奶的发酵剂。     

乳粉中发酵乳杆菌CECT5716微生物检测方法的建立

近年来乳粉中添加益生菌逐渐成为研究热点之一,为保证产品质量和安全,建立乳粉中发酵乳杆菌CECT5716的微生物检测方法。结果表明：在以缓冲蛋白胨水为稀释液进行10 倍系列稀释后,采用MRS平板涂布法,（36±1） ℃厌氧培养（48±2） h后,乳粉中发酵乳杆菌可准确计数,且能与乳粉中添加的双歧杆菌属细菌明显区分;该方法较GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》方法更适合发酵乳杆菌计数,具有区分度高、培养时间短、操作简单、重复性好、准确性高的优点;该方法增加了菌株16S rDNA序列测定,以进一步对发酵乳杆菌进行分子鉴定;通过对20 份自制样品进行检测评价,表明所建立的方法与国标方法的准确性无显著性差异（P=0.127）。     

唾液乳酸杆菌TCSL1对幼犬生长性能、血液学与血清生化指标及肠道健康的影响

本研究旨在评价唾液乳酸杆菌TCSL1对犬生长性能、血液学与血清生化指标及肠道健康的影响,为研发犬用益生菌制剂奠定基础。选取24只6周龄左右的健康中华田园犬,随机分为4组,每组6只。试验组按低（5×10⁶ CFU/mL）、中（5×10⁸ CFU/mL）、高（5×10¹⁰ CFU/mL）剂量分别口服唾液乳酸杆菌TCSL1,对照组口服生理盐水,进行为期28 d的喂养试验。试验期间,定期观察并记录犬的行为、饮食和腹泻情况,28 d后分别称重,计算犬体重增长量。采集血液样品检测血液学、血清生化、肠道屏障与炎性细胞因子指标;采集粪便检测分泌型球蛋白sIgA含量和肠道主要细菌数量。结果表明,①与对照组相比,试验组均能促进犬体重的增长,降低腹泻率,与口服剂量呈正相关。淋巴细胞数、红细胞数、免疫球蛋白和碱性磷酸酶含量等均有升高趋势,丙氨酸氨基转氨酶和尿素氮等含量呈降低趋势,组间差异显著（P<0.05）;②随口服唾液乳酸杆菌剂量的增加,试验组血清中的二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-lactic acid）和脂多糖（LPS）等肠道屏障指示因子含量显著下降（P<0.05）;③试验组血清促炎细胞因子TNF-α和IL-6含量显著降低（P<0.05）,抗炎细胞因子TGF-β1和IL-10含量则显著升高（P<0.05）;④试验组粪便中的分泌型免疫球蛋白sIgA含量显著增加（P<0.05）,大肠杆菌和肠球菌数量显著下降（P<0.05）,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著增加（P<0.05）。以上结果表明,口服唾液乳酸杆菌TCSL1可改善幼犬生长性能、增强肠道健康,降低腹泻率,以每天5×10¹⁰ CFU/mL剂量口服效果最佳。     

全子叶生物活性豆腐凝胶特性的研究

通过因子筛选实验,确定了接种量、微生物转谷氨酰胺酶(MTG)用量和水豆比是影响全子叶生物活性豆腐凝胶特性的关键因子。在此基础上,采用响应曲面法(Response SurfaceMethodology,RSM)分别建立了豆腐硬度和持水率的二次多项数学模型,验证了模型的有效性并探讨了上述3个因子的交互作用。从产品成本和凝胶特性综合考虑,选择出最佳配比,即乳酸菌接种量为105cfu/mL,MTG用量为347 U/L,水豆比为8.5,其硬度和持水率实测值分别为44.8g和89.2%,可生产出富含乳酸菌和几乎全部大豆营养的健康豆腐。     

不同添加剂及贮藏温度对发酵全混合日粮品质和真菌数量的影响

本试验旨在探究添加剂及贮藏温度对发酵全混合日粮（Fermented Total Mixed Rations,FTMR）的影响,为FTMR在生产实践中的应用提供科学依据。试验设置了布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri,LB）、没食子酸（Gallic acid,GA）、果胶酶（Pectinase,PE）,共3个添加剂和对照组（CK）,4个不同的贮藏温度（10℃、20℃、30℃和40℃）,发酵7 d后取样。结果表明,随着贮藏温度的升高,各处理的pH值均显著降低,CK、LB和GA处理组的pH值于30℃达到最低,PE处理组于40℃达到最低（P<0.05）;随着贮藏温度的升高,各处理组中乙酸和丙酸的含量均显著升高（P<0.05）,其中乙酸的含量于30℃时达到最高,丙酸的含量于40℃时达到最高;添加PE后,FTMR的pH值在10℃、30℃和40℃下均显著低于其他处理组（P<0.05）。综上,贮藏温度为30℃和40℃时FTMR的发酵品质较好,当贮藏温度为10℃、30℃和40℃时添加果胶酶可以提高FTMR的发酵品质。     

表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠诱导的免疫应答分析

旨在构建表达猪圆环病毒2型（PCV2）cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri,L.reuteri）,并评价其在小鼠体内诱导的免疫应答效果。利用PCR扩增实验室分离保存的PCV2b型毒株的cap蛋白基因,以猪源L.reuteri为宿主菌,构建表达cap蛋白的重组菌株pPG-T7 g10-PPT-cap/L.reuteri,通过口服免疫BALB/c小鼠。采用间接ELISA方法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平,粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中抗原特异性sIgA抗体水平,小鼠血清中各细胞因子水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞技术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的水平;荧光定量PCR检测免疫后攻毒的小鼠体内器官的病毒载量。结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中sIgA抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠血清中细胞因子水平和对照组相比,IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化;体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞结果表明,重组乳酸菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组（P<0.01）;流式细胞技术检测结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞含量高于对照组;荧光定量PCR结果显示,相比于对照组,口服免疫重组乳酸菌组小鼠体内的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌,经口服途径免疫动物,构建的重组乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且具有一定的免疫保护效果。     

干酪乳杆菌蛋白酶纯化与动力学性质

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)6033经增菌培养、超声波破碎、冷冻离心后获得粗酶液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀后,分别进行阴离子交换层析、疏水层析、分子筛层析,最终获得1种纯蛋白酶。该酶分子量为61 2kD,可被苯甲基磺酰氟(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA)强烈抑制,Co2 和Ca2 能增强该酶活力,Fe3 、Zn2 和Cu2 对其活性则有抑制作用。该酶在37℃时,最大酶活力出现在pH值7 0附近,pH4 0时相对酶活力下降到39 0%,而pH9 0时相对酶活力仅维持在8 0%左右。pH7 0时该酶的最适温度为37℃左右,20℃时相对酶活力下降到54 0%,而60℃时相对酶活力仅为34 0%。以酪蛋白作为底物时测得该酶Km值为1 5mg/ml、Vmax为32 0。