猪圆环病毒与胸膜肺炎放线杆菌混合感染的诊治

2019年3月,大庆某规模化猪场个别猪出现发育不良、咳喘、消瘦、皮肤苍白和呼吸困难等症状,随后出现死亡。为明确发病原因,降低损失,对送检病死猪进行临床症状观察、剖检及实验室检测,并对病原菌进行药物敏感性试验。检测结果为致病性胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒混合感染所致,分离的胸膜肺炎放线杆菌对阿莫西林和头孢唑高度敏感。本研究为养殖场饲养猪的死亡病因分析和防治提供了参考。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

目的建立可以同时检测猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速而可靠的PCR检测方法。方法和结果根据胸膜肺炎放线杆菌的Apx-VIA基因序列、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因序列设计5条引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模板的PCR扩增产物大小分别为342bp,485bp和1258bp。复合PCR对1～12型猪胸膜肺炎放线杆菌标准株,6株多杀性巴氏杆菌标准株,1～15型副猪嗜血杆菌以及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检测,均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等14种常见细菌作为阴性对照进行PCR检测,结果仅有支气管败血波氏杆菌产生了可以和上述三个特异性条带明显区分的PCR产物。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的敏感性分别为14pg、34pg和37pg。结论本研究建立的复合PCR特异性好,敏感性高,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。     

斑点杂交法检测猪传染性胸膜肺炎

将位于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP) apx A毒素基因 3′端的长为 442 bp的DNA片段作为模板制备出地高辛标记的 APP核酸探针。敏感性检测结果表明 ,该探针对 APPDNA的最低检出量为 1 .8ng。特异性检测结果表明 ,该探针能与 APP1～ 1 0血清型标准菌株 DNA抽提物发生特异性杂交反应 ,而与多杀性巴氏杆菌A型和 B型、链球菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 DNA进行的杂交反应均为阴性。应用该探针对临床 6份阳性病料 ,1 1份纤维渗出性病料进行检测 ,结果阳性病料全部检出 ;而对于 1 1份纤维渗出性病料 ,斑点杂交检出 4份是阳性 ,比 PCR方法 6/ 1 1的检出率要低 ,但仍表明所制备的探针用于 APP的检测是一种比较敏感、特异的诊断方法。     

Porcine CD18 mediates Actinobacillus pleuropneumoniae ApxIII species-specific toxicity

Actinobacillus pleuropneumoniae, the causative agent of porcine pleuropneumonia, produces Apx toxins that are recognized as major virulence factors. Recently, we showed that ApxIIIA-cytotoxic activity specifically targets Sus scrofa leukocytes. Since both LtxA from Aggregatibacter actinomycetemcomitans (aggressive periodontitis in humans) and LktA from Mannheimia haemolytica (pneumonia in ruminants) share this characteristic, respectively towards human and ruminant leukocytes, and because both use the CD18 subunit to interact with their respective LFA-1, we hypothesized that ApxIIIA was likely to bind porcine CD18 to exercise its deleterious effects on pig leukocytes. A β ₂−integrin-deficient ApxIIIA-resistant human erythroleukemic cell line was transfected either with homologous or heterologous CD11a/CD18 heterodimers using a set of plasmids coding for human (ApxIIIA-resistant), bovine (-resistant) and porcine (-susceptible) CD11a and CD18 subunits. Cell preparations that switched from ApxIIIA-resistance to -susceptibility were then sought to identify the LFA-1 subunit involved. The results showed that the ApxIIIA-resistant recipient cell line was rendered susceptible only if the CD18 partner within the LFA-1 heterodimer was that of the pig. It is concluded that porcine CD18 is necessary to mediate A. pleuropneumoniae ApxIIIA toxin-induced leukolysis.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离株的分子生物学鉴定

根据已有的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP) dsbE基因序列,合成了一对特异性引物,从3株APP分离菌(BZ1株,BZ2株和BZ3株)均扩增出预期342 bp的DNA片段.分别将扩增的目的基因连接到pMD18-T载体中,构建重组质粒,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,提取质粒并进行序列分析.结果表明BZ1株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因的同源性达98%～100%,BZ2株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因的同源性达98%～99%,BZ3株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因同源性达97%～98%,证明3株分离菌均为APP.     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白结构与功能的研究

猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起猪传染性胸膜肺炎,是猪的最重要呼吸道传染病之一。通过筛选APP 3～8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为APP Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子量为45.716 KD。根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应;研究还发现,纯化的Ⅱ型分泌蛋白能结合C3。     

Pleuritis in slaughter pigs: Relations between lung lesions and bacteriology in 10 herds with high pleuritis

Pleuritis in slaughter pigs has increased in recent years in the Netherlands. The aim of the present study was to determine what respiratory pathogens were involved in pleuritis.In total, lungs of 968 slaughter pigs from 10 herds with high prevalence of pleuritis were morphologically examined for size, location, and type of lesions. Moreover, histology and bacteriology were performed.Examination of gross lung lesions showed 45% pleuritis, 14% pleuropneumonia and 38% catarrhal pneumonia. Peribronchiolar cuffing was found in 61 of 142 samples. Actinobacillus pleuropneumoniae was cultured from 22 lung samples from four herds. Pasteurella multocida was cultured from 55 lung samples in eight herds. No specific pattern with respect to the causal pathogens was found.In conclusion, no single infectious cause of pleuritis was found. A variety of infectious agents combined with environmental factors should be considered as a cause of pleuritis.     

副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

在已建立的副猪嗜血杆菌(HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)的单重PCR检测方法的基础上,通过对扩增条件的优化,利用一次PCR反应可同时扩增出APP的256 bp、Pm的457 bp、HPS的822 bp的特异性片段,建立了HPS、Pm、APP的多重PCR实验室诊断方法。该复合PCR可检测60 pg的HPS、120 pg的Pm、50 pg的APP。利用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性猪体内分离到的39株细菌,结果显示HPS、Pm、APP分别为12、16、2株,对39份病料的检测与常规细菌分离鉴定结果一致,可见该方法适用于HPS、APP、Pm的临床快速检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据已经发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(App)dsbE-like基因的序列,设计了一对可扩增374bp目的片段的特异性引物。经PCR扩增,App1-4和6-10型标准菌株均能扩出约374bp的片段,而对大肠埃希菌(K88)、巴氏杆菌(5:A)和链球菌(Ⅱ)的扩增结果均为阴性。用建立的方法来检测分离菌株MC、ME和MH,结果表明,该方法能用于临床分离株的检测。灵敏性试验表明本方法对App菌液最低检出浓度为71cfu/mL。建立的PCR检测App的方法可用于临床上对App的检测。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒2型二重实时荧光定量PCR检测方法的建立

以胸膜肺炎放线杆菌(App)apx ⅣA基因和猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因为靶基因,分别设计特异性引物和探针,建立App和PCV-2的二重荧光PCR方法。App引物扩增的目的片段大小为132bp,PCV-2为169bp。建立的方法可在同一反应体系中同时对App和PCV-2进行定量检测鉴别,其敏感性分别为1×101拷贝和1×100拷贝,对其他猪病病原核酸的检测为阴性。利用该方法对10份人工感染临床样品进行检测试验,其结果符合率达100%,说明该方法可用于对临床样品中App和PCV-2的检测。