抗重金属Cr3+单克隆抗体的研制及其免疫学特性分析

旨在研制敏感、特异、稳定的抗Cr~(3+)单克隆抗体(Cr~(3+)mAb)。用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)鳌合Cr~(3+)形成Cr~(3+)-ITCBE半抗原,异硫氰酯法制备人工免疫原Cr~(3+)-ITCBE-BSA和检测抗原Cr~(3+)-ITCBE-OVA,紫外扫描法(UV)、凝胶电泳法(SDS-PAGE)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICPAES)进行免疫原鉴定;用Cr~(3+)-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立Cr~(3+)mAb杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备Cr~(3+)mAb,并对其免疫学特性进行分析。结果表明,免疫原制备成功,Cr~(3+)-ITCBE-BSA中Cr~(3+)和BSA的质量浓度分别为140.8mg/L和5.81g/L,筛选出2A3C11、2A3D9、2A11G5 3株杂交瘤细胞,其中最好的2A11G5间接ELISA效价细胞培养上清为1∶(2.56×103)、腹水为1∶(5.12×105),同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为2.69×109 L/mol,对Cr~(3+)的半数抑制质量浓度(IC50)为16.6μg/L,与其他重金属离子无交叉反应。表明成功研制亲和力高、特异性强、稳定性好的Cr~(3+)mAb,为铬离子残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

[目的]探讨系统地检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的方法。[方法]通过三甲氧苄氨嘧啶与马来酸酐反应,得到三甲氧苄氨嘧啶半抗原,再通过免疫动物得到抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体,并将其应用于能够检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的ELISA试剂盒。[结果]试验表明,该试剂盒对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34μg/kg,IC50(50%抑制浓度)为4.8μg/L,回收率为60.5%~79.7%,试剂盒的标准曲线范围为0~80μg/L,批内、批间的相对标准偏差均小于10%,三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%,4℃下能够保存12个月,稳定性较好。[结论]研究可为监管三甲氧苄氨嘧啶的滥用提供参考。     

沙拉沙星单克隆抗体制备及鉴定

为制备敏感性好、亲和力高、特异性强的抗沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)单克隆抗体,采用碳二亚胺法合成SARA人工抗原,通过免疫BALB/c小鼠,选择血清效价高且敏感性好的小鼠,采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,筛选分泌抗SARA单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备SARA mAb,通过间接ELISA和间接竞争ELISA对SARA mAb的免疫学特性进行鉴定。结果表明:小鼠经免疫原免疫后,小鼠多抗血清效价均达到1∶128 000。选择敏感性较好的2号小鼠进行细胞融合,经多次亚克隆后,筛选出1G3、3H3两株杂交瘤细胞株,其中1G3所产SARA mAb效价较高,为1∶512 000,IC_(50)为6.34 ng/mL,亲和常数为8.55×10~8L/mol,与诺氟沙星的交叉反应率为1.06%,与其他药物交叉反应率均低于0.50%。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备

本研究利用已构建的基因工程重组菌表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2编码的Cap蛋白,纯化后作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经间接免疫荧光试验(IFA)筛选及有限稀释法进行3次亚克隆后,本试验最终获得5株稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3D12、4D5、4B9、4C9和4G10。其中4D5为IgG2b亚型,其余4株单克隆抗体均为IgG1亚型,轻链类型均为κ。Western blotting鉴定结果表明获得的5株单克隆抗体均不能特异性的识别47 ku重组PCV2 Cap蛋白;对病毒感染细胞进行IFA试验,结果显示5株单克隆抗体均特异性的识别病毒抗原,表明5株单克隆抗体识别的抗原表位均为构象表位。中和试验结果表明,5株单克隆抗体均有中和活性。本试验结果为进一步探索ORF2基因的结构、功能及建立快速准确的诊断方法奠定了基础。     

Identification and characterization of a late gene encoded by grouper iridovirus 2L (GIV‐2L)

Grouper iridovirus (GIV) belongs to the Ranavirus genus and is one of the most important viral pathogens in grouper, particularly at the fry and fingerling stages. In this study, we identified and characterized the GIV‐2L gene, which encodes a protein of unknown function. GIV‐2L is 1242 bp in length, with a predicted protein mass of 46.2 kDa. It displayed significant identity only with members of the Ranavirus and Iridovirus genera. We produced mouse monoclonal antibodies against the GIV‐2L protein by immunizing mice with GIV‐2L‐His‐tag recombinant protein. By inhibiting de novo protein and DNA synthesis in GIV‐infected cells, we showed that GIV‐2L was a late gene during the viral replication. Finally, immunofluorescence microscopy revealed that GIV‐2L protein accumulated in both the nucleus and cytoplasm of infected cells. These results offer important insights into the pathogenesis of GIV.     

基于纳米材料电化学免疫传感器检测禽呼肠孤病毒研究

【目的】构建一种用于检测禽呼肠孤病毒(ARV)的新型电化学免疫传感器。【方法】将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,加入HAuCl4溶液于80℃还原成金纳米粒子（AuNPs）,得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNPs)纳米复合物。将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,先加入AgNO3溶液于80℃还原成银纳米粒子（AgNPs）,再加入禽呼肠孤病毒单克隆抗体(ARV-MAb),得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子-禽呼肠孤病毒单克隆抗体（G-Chi-AgNPs-ARV-MAb）纳米复合物。将G-Chi- AuNPs纳米复合物修饰金电极作为传感器平台,固定待检测样品,然后加入G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物,并对G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的孵育时间进行优化,构建了ARV电化学免疫传感器。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、新城疫病毒（NDV）、喉气管炎病毒（LTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和传染性法氏囊病毒(IBDV)进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的特异性。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对106.5-100.5 TCID50/mL的病毒进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的敏感性试验。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对临床样品进行检测,其确定ARV电化学免疫传感器的实用性。【结果】所建立的ARV电化学免疫传感器,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的最佳孵育时间为40 min。当检测的样品为阳性时,ARV与ARV-MAb特异结合,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物被固定到电极的表面使其线性伏安曲线出现AgNPs的氧化峰;当检测样品为阴性时,其线性伏安曲线不出现AgNPs的氧化峰。特异性结果表明,所建立的方法仅对ARV的检测为阳性（出现AgNPs的氧化峰）,而对非目标禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、NDV、LTV、IBV和 IBDV的检测为阴性（不出现AgNPs的氧化峰）。敏感性结果表明,所构建的ARV电化学免疫传感器,具有很高的敏感性,对ARV检测的敏感性达101.5 TCID50/mL。使用建立的ARV电化学免疫传感器对22份临床样品进行检测,结果与病毒分离方法相符。【结论】所建立的ARV电化学免疫传感器,具有特异性强、敏感度高及快速的特点,为有效检测诊断禽呼肠孤病毒提供了一种新的快速检测诊断技术。     

猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析

为获得针对猪源EMCV结构蛋白VP2的特异性单克隆抗体,本试验以EMCV结构蛋白VP2为对象,将EMCVBJC3株VP2基因定向插入穿梭质粒中,构建重组腺病毒AdV—VP2,免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体,利用Pepscan技术对单抗识别的抗原位点进行分析。结果显示,间接ELISA及间接免疫荧光法筛选获得了2个阳性细胞克隆株,命名为C11和G8。经检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：1600,腹水效价分别为1：2．56×106和1：1.28×106,中和试验鉴定均无中和活性。Western—blot鉴定表明获得的2株单抗均能识别原核表达的重组VP2蛋白。亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG2b亚类,轻链均为κ型。Pepscan分析结果显示,这2株单抗可分别识别EMCVVP2蛋白上的2个B细胞线性表位。本研究获得的蛋白十分接近于其天然构象,很大程度上保证了病毒表面抗原位点的结构和功能。     

赤羽病病毒的纯化及其单克隆抗体的制备

将人工繁殖、纯化的赤羽病病毒作为免疫原,通过常规杂交瘤技术,制备亲和性强、特异性好的小鼠抗赤羽病病毒单克隆抗体,并进行相应的纯化和标记工作。以澳大利亚进口的试剂盒进行验证,结果证明:进口单抗与我们制备的AAK纯品及AAK-HRP显示同样结果;且质控结果表明,AAK纯品及其衍生物AAK-HRP的特异性和亲和性均基本满足进行封闭ELISA检测方法的要求,为制备国产化ELISA试剂盒提供了基础。     

大豆主要过敏原Gly m Bd30K蛋白单克隆抗体的制备与应用

利用大豆主要过敏原Gly m Bd 30K蛋白抗原表位蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合.采用半固体培养基法和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化.采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体...