低温胁迫下马铃薯的数字基因表达谱分析

以马铃薯品种合作88为材料,利用数字基因表达谱(DGE)技术,对–2℃低温胁迫处理后的马铃薯叶片c DNA文库进行差异基因表达谱分析。结果表明,有28 505个基因受低温胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因13 703个,下调表达基因14 802个。GO功能显著性富集分析表明,DEGs主要涉及信号生物代谢过程、氧化还原过程、能量代谢、次生代谢过程以及催化活性。KEGG富集分析表明,上调表达基因主要富集于苯丙烷、光合作用天线蛋白、类胡萝卜素的生物合成、苯丙氨酸代谢及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物激素信号转导途径。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证4个DEGs在低温胁迫条件下的差异表达,其结果与DGE分析结果基本一致,证实了DGE测序结果的可靠性。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

基于质粒表达的siRNA对猪圆环病毒2型(PCV2)复制的抑制作用

猪圆环病毒2型(PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的必要病原,对养猪生产构成了严重威胁,但当前缺乏有效的防治手段.为了探索治疗PCVAD的新途径,分别针对PCV2的病毒复制相关蛋白基因(rep)与衣壳蛋白基因(cap),构建了PCV2特异的siRNA表达质粒(pGensil-R259、pGensil-C297和pGensilC490)和PCV2非特异的阴性对照质粒(pGensiI-SCR).在脂质体介导下,将构建的siRNA表达质粒与阴性对照质粒转染PK-15细胞,转染质粒20 h后感染PCV2.结果质粒表达的特异siRNA抑制了PCV2 DNA的合成及Rep和Cap蛋白的表达,使病毒滴度(TCID50)显著下降;针对靶基因不同位点的siRNA的抑制效果不同,病毒感染后36 h内,siRNA对PCV2的抑制作用最强,随后有所下降,但直至感染后60 h仍然能够显著抑制PCV2复制.实验结果提示质粒表达的特异siRNA能够显著地抑制PCV2的增殖,但这种抑制功能与作用时间呈负相关.     

哈密瓜果实转录因子CmCBF_1的克隆及表达分析

【目的】研究CBF在哈密瓜果实采后抗冷过程中的调控功能,对转录因子CmCBF_1进行克隆与表达分析,为进一步研究哈密瓜果实低温贮藏过程中的冷害发生机制提供理论依据。【方法】以新密3号采后离体果实为试材,根据已报道的甜瓜CBF1预测序列(XM_008440940),与基因组甜瓜组(https://melonomics.net)进行BLAST比对,确定基因编码区起始和终止位置,针对CBF1编码区设计特异性引物,通过对果实c DNA进行扩增,获得CBF1全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在不同温度条件下的表达特性。【结果】克隆获得哈密瓜果实转录因子CBF1,命名为CmCBF_1,该基因序列为639 bp(Gen Bank登录号为KT737742),编码212个氨基酸,蛋白质分子量为23.89 k Da,等电点为5.23;同源性分析表明,哈密瓜果实转录因子CmCBF_1与草莓Fa CBF1亲缘关系较近,达到85%。qRT-PCR分析结果显示,哈密瓜果实转录因子CmCBF_1在1、3及5℃低温诱导条件下特异性表达,在20℃室温条件下几乎不表达。【结论】转录因子CmCBF1的表达与哈密瓜果实采后冷害发生负相关(r=-0.663)。     

普通小麦春化基因VRN1 RNA干扰载体构建及转基因小麦获得

为进一步探究春化基因VRN1在小麦发育进程中的功能,利用荧光定量PCR分析了VRN1基因在不同发育特性小麦品种新春2号、京841中的表达情况。结果表明,随着生育进程的推进,VRN1基因在新春2号叶片和茎尖中表达量均呈上升趋势,VRN1基因在京841叶片中呈波动上升趋势,在茎尖中表达量趋于0;以p FGC5941载体为基础构建含有VRN1反向重复序列的RNA干扰载体,利用农杆菌介导的茎尖转化法转化新春2号获得了再生植株,并通过PCR法检测获得了转基因阳性植株,为从分子水平上实现小麦发育特性遗传改良和创育小麦新种质奠定了基础。     

蓖麻环核苷酸门控离子通道RcCNGC2克隆与盐胁迫下表达分析

为探讨RcCNGC2在蓖麻耐盐中的作用,以通蓖5号叶片为材料,克隆获得环核苷酸门控离子通道RcCNGC2完整编码区序列(CDS),并对该序列进行序列比对、蛋白结构分析,构建多元表达载体,分析了在盐胁迫下蓖麻RcCNGC2基因根、茎、叶组织中6个时间点的表达量变化。结果显示,RcCNGC2 CDS长度为2 148 bp,编码715个氨基酸,蛋白分子量为34.15 ku,等电点为9.96,存在5个跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCNGC2与橡胶树一致性最高,达89.15%。qRT-PCR分析结果显示,NaCl处理后RcCNGC2表达量在根中上调且差异显著,在茎、叶中随NaCl处理时间延长而显著减少。综上,RcCNGC2在蓖麻受到盐胁迫时起重要信号传导作用。     

青天葵1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因片段的鉴定和分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是植物萜类MEP生物合成途径的第一个限速关键酶,提高其编码基因的表达可提高植物萜类化合物的含量。该研究在青天葵全转录组测序数据中获取青天葵DXS基因片段序列,利用生物信息学方法对其系统发育进化、保守功能域、理化性质、亲/疏水性、跨膜结构域、信号肽等进行分析和预测,并采用RPKM法分析其在青天葵叶片和球茎的表达量,为后期利用DXS基因调控青天葵萜类成分的生物合成提供理论依据。结果表明:NfDXS基因片段序列长度为2 154bp,编码含有718个氨基酸、分子量约为77.45kDa的亲水性蛋白,与其它DXS同源性可达80%。NfDXS具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶功能域,没有信号肽和跨膜结构域,二级结构表现为混合型结构蛋白质。NfDXS基因在青天葵中的表达趋势为:叶片球茎。     

分枝杆菌噬菌体CJAUS 5株lysA基因的克隆与表达

为了研究分枝杆菌噬菌体裂解酶lys A的生物学特性及对宿主菌的作用,对分枝杆菌肌尾噬菌体CJAUS5的lys A基因进行PCR扩增、克隆和原核表达,并利用生物信息软件对其序列进行分析。结果显示,CJAUS5-lys A基因与Gen Bank中分枝杆菌肌尾噬菌体的lys A基因具有高度同源性;克隆基因在大肠杆菌BL21中获得了成功表达,重组蛋白以包涵体的形式存在,蛋白分子量约为52 k Da;lys A蛋白保守区域分析结果显示,lys A包含具有酰胺酶活性的肽聚糖识别蛋白(PGRP)超家族,表明Lys A可能具有裂解肽聚糖的能力。本研究克隆表达出分枝杆菌噬菌体CJAUS5裂解酶Lys A,为进一步研究其相关功能奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒S1蛋白基因的克隆与原核表达

根据GenBank中IBV基因序列,设计合成一对引物,成功地从IBV H52基因组中扩增了S1基因。经测序证实该序列全长1 685 bp,编码538个氨基酸。为便于表达,对其进行弃信号肽克隆,然后定向连接到表达载体中获得重组表达质粒pGEX-S1,转入受体菌,经诱导成功的表达了重组蛋白GST-S1。SDS-PAGE显示,该蛋白约为80 kD,占菌体总蛋白的8%,West-blot表明,其具有良好的免疫学活性。IBV S1基因的克隆和表达,为研究病原与细胞相互作用、开发基因工程疫苗奠定了基础。