普通小麦春化基因VRN3的表达分析及过表达载体构建

通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了不同发育特性的普通小麦品种VRN3基因的表达,结果表明：VRN3基因在春性品种新春2号叶片中表达呈上升趋势,在雌雄蕊分化期达到最大值,在强冬性品种京841中表达量很低;VRN3在新春2号和京841茎尖中的表达量均极低。以京841的cDNA为模板扩增VRN3基因全长,连接到pCAMBIA3301载体上,构建VRN3基因过表达载体,通过农杆菌茎尖转化法获得了转基因植株,研究结果为春化基因VRN3对小麦春化发育调控的进一步研究提供依据。     

小麦AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析

从大粒型小麦品种豫教2号中克隆出调控小麦ADPG焦磷酸化酶(AGPase)胞质型大亚基基因(LSU I)cDNA全长。在花后15 d的小麦植株中, 通过半定量PCR法, 发现LSU I基因在叶、籽粒、叶鞘和颖壳中表达量较高, 但在根和茎中表达量较低, 表明在绿色光合功能器官和淀粉合成器官中, LSU I基因量表达较高。比较了LSU I基因在千粒重不同的豫教2号和兰考矮早八两小麦品种籽粒发育过程中的表达差异后, 发现在籽粒形成期, LSU I基因在两品种籽粒内表达相似, 但在籽粒灌浆期和成熟期间, LSU I基因在千粒重较高的豫教2号内表达量明显高于千粒重较低的兰考矮早八, 这个表达差异与两品种间淀粉积累差异趋势相似, 表明LSU I基因的表达量可能与淀粉的积累量密切相关。     

农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化

利用C58c1农杆菌菌株（其携带的pPTN290质粒载体上含有nptⅡ 基因和GUS基因）为供体材料和小麦幼胚为受体材料,对我国35个春小麦基因型进行了农杆菌敏感性研究和转化研究。组织化学染色结果表明,PM97034、P187、巴140105、扬麦158、新春9号和克丰6号等基因型农杆菌感染后GUS基因瞬时表达率达到了15.0% ~ 30.0%,显著高于模式基因型Bobwhite。其余幼胚分别在含10-25mg/L G418培养基上诱导愈伤组织和分化植株,抗性再生植株经ELISA检测、PCR检测、叶片离体退绿检测、X-Gluc染色检测和Southerm blot检测,最终从新春9号和PM97034的农秆菌转化效率高于Bobwhite. Southerm blot检测结果同时表明,外源基因在多数转基因植株中表现为单拷贝整合。T₁代植株ELISA检测结果和PCR检测结果表明,外源基因在个别株系中的分离符合孟德尔遗传规律,而在多数株系中的分离偏离了孟德尔遗传规律。阳性植株与阴性植株分离比经X²。适合性检测,表明外源基因在多数株系中的遗传符合3：1分离规律。本文首次对不同小麦基因型进行了农秆菌敏感和转化效率研究,筛选到新春9号和PM97034两个对农杆菌比较敏感且转化效率比较高的基因型,可望广泛用于小麦转基因研究。     

小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化

以小麦的幼穗和幼胚作为转化受体,首次用抗除草剂草甘麟的EPSPs基因作为选择标记,通过基因枪法共转化,将小麦编码高分子量谷蛋白亚基的基因1Dx5和1Dy10转移到普通小麦京花1号中,获得33株再生植株,经PCR初步检测有12株同时扩增到了3个处在不同质粒上的外源基因EPSPs, 1Dx5和1Dy10的目标片段。将部分PCR检测为阳性的转化体     

小麦miR395a前体克隆、遗传转化及组织表达模式分析

miRNA是一类在调控植物发育和生物及非生物逆境胁迫响应过程中发挥重要功能的非编码小RNA,为了探究miR395a在小麦抗病中的功能和作用机制,比较了不同物种中的miR395a成熟序列,分析发现miR395a在不同物种中具有较高的保守性,其中小麦与拟南芥、番茄以及大豆中的miR395a成熟序列具有高度一致性。并从小麦叶片中克隆了miR395a的前体序列,并将其连接到植物表达载体pCambia1301上,构建了miR395a前体的过量表达载体,之后通过农杆菌介导的遗传转化法,转化至小麦栽培品种(百农207)中,获得56株转基因植株,并通过PCR鉴定出11株阳性转基因植株。用RT-qPCR技术对不同组织中miR395a的表达量进行分析,结果显示,miR395a为组成型表达,但在不同组织中的表达量有差异,其中在三叶期和抽穗期叶片中的表达量较高,叶鞘中次之,旗叶中表达量最低。综上,获得了过量表达miR395a前体的小麦转基因植株,为进一步研究miR395a在小麦抗病中的功能及作用机制提供了材料来源。     

普通小麦Trx59基因的克隆及功能验证

为进一步挖掘小麦春化相关基因,探明小麦春化发育调控机制,从不同春化发育特性小麦品种春化响应转录组高通量测序结果中筛选并克隆到1个EST序列,命名为Trx59,该基因的开放阅读框为372 bp,编码124个氨基酸,保守结构域分析显示,Trx59基因有1个Thioredoxin结构域。利用qRT-PCR分析了在春化处理过程中Trx59基因在不同春化发育特性小麦品种的表达特性,并利用VIGS技术进行基因功能的初步验证。结果表明:随着春化处理时间的延长,Trx59基因的表达量逐渐升高,从表达量和表达时间来看,Trx59基因的表达量和表达时间表现为春性品种高于且早于冬性品种。构建BSMV:Trx59重组载体并接种于小麦植株,14 d后出现明显的光漂白现象,Trx59基因的表达水平急剧降低,说明Trx59基因已被显著抑制;BSMV:Trx59接种的小麦植株穗分化明显晚于阴性对照组,初步判断Trx59基因与小麦发育有关。     

小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析

目前已克隆出许多类甜蛋白基因并成功转化马铃薯、水稻和小麦等植物,均可引起植株抗病性的提高。在以往的研究中我们从小麦中克隆了一个类甜蛋白基因(Ta-Tlp),该基因在高抗白粉病的小麦6VS/6AL易位系中能够高水平表达,推测它与白粉病抗性密切相关。为进一步研究该基因的功能,本研究构建了包含在ubi强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,用基因枪将其导入小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织,在含除草剂的选择培养基上经两轮筛选和分化,获得再生抗性植株。对T0、T1和T2代植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,结果表明Ta-Tlp基因已整合进受体基因组并且能够表达。对T0代及其衍生的T1代(来自6个T0代阳性株系的183个单株)和T2代(来自6个T0代阳性株系的241个单株)转化植株进行白粉病抗性鉴定,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,其白粉病抗性有一定提高。对T2代阳性转化植株进行赤霉病抗性鉴定表明,其抗性与受体对照相比无显著差异。     

棉花GaLMI1-like基因功能及其启动子表达分析

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。     

用基因枪法获得转异天南星基因aha抗蚜虫小麦

凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白,对蚜虫等害虫有很强的抗杀作用。利用异天南星凝集素基因aha(Arisaema heterophyllum agglutinin)以及水稻Rubisco小亚基启动子,构建了aha基因植物绿色组织特异性表达载体,并采用基因枪转化方法, 与携带bar基因的pAHC20载体共转化到小麦品种科农199中。经过愈伤诱导、再生和筛选以及PCR鉴定,获得aha转基因植株42株,平均转化效率为2.41%。对转aha基因植株后代PCR鉴定表明,T₁代转基因植株的分离比例基本符合孟德尔遗传规律。利用室内多目标综合判别法评定抗蚜虫特性,8个T₁代转基因株系中有高抗材料1份,低抗材料3份,占参试比例44.4%。本研究为获得抗蚜虫转基因小麦新材料奠定了基础。     

GsZFP1基因植物表达载体构建及对苜蓿的遗传转化

从野生大豆中获得的具有耐旱、耐冷特性的锌指转录因子GsZFP1基因,构建到以CaMV35S为启动子、E12为增强子的植物表达载体pCEOM中,以bar基因为筛选标记基因,通过农杆菌介导法将构建的植物表达载体转化苜蓿品种农菁1号的子叶节,用含0.5mg/L草丁磷的筛选培养基进行筛选,获得了70株抗性植株,用PCR检测得到20株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行GsZFP1基因的RT-PCR鉴定,获得3株RT-PCR阳性植株。结果表明,GsZFP1基因在苜蓿中得到表达。     

新疆春小麦品种萌发期抗旱性评价

研究干旱胁迫条件下新疆春小麦不同品种间抗旱性的差异。以20% PEG-6000 作为水分胁迫剂,对10个新疆春小麦品种的发芽率、发芽势、相对芽长、相对根长、相对发芽率、萌发抗旱指数进行研究分析,并通过加权隶属函数法对供试材料的抗旱性进行了综合评价。结果表明：1)与对照相比,20%浓度的PEG胁迫后,发芽率、发芽势、相对芽长、相对根长、相对发芽率均受到抑制,不同品种降幅不同;2) 通过隶属函数法对上述指标进行综合评价分析,10份春小麦的综合评价值(D值)在0.01~0.82之间,中国春为强抗旱品种(1级),新春3号、新春6号、新旱688等3个品种为中抗品种(2级),新春2号、新春26号等2个品种为弱抗旱品种(3级),新春7号、新春17号、新春20号、新春21号等4个品种为不抗旱品种(4级)。因此,新旱688、新春3号、新春6号可作为新疆小麦抗旱育种的种质资源。     

Level of VERNALIZATION 1 expression is correlated with earliness in extra early-flowering mutant wheat lines

Four extra early-flowering mutants, named extra early-flowering1 (exe1), exe2, exe3, and exe4, were identified in Triticum monococcum strain KU104-1 following heavy-ion beam mutagenesis. The four exe mutants fell into two groups, namely Type I (moderately extra early-flowering type; exe1 and exe3) and Type II (extremely extra early-flowering type; exe2 and exe4). Analysis of plant development in a growth chamber showed that the speed of leaf emergence was accelerated in exe mutants at the reproductive stage compared to wild-type (WT) plants. The speed of leaf emergence was faster in Type II than Type I plants. Analysis of VERNALIZATION 1 (VRN1), a flowering promoter gene, showed that it was more highly expressed in seedlings at early developmental stages in Type II mutants than Type I mutants. These findings indicate that the difference in earliness between Type I and Type II mutants is associated with the level of VRN1 expression. The original KU104-1 is an einkorn wheat strain that carries a null allele of the VRN2 gene, a repressor of flowering. Thus, our results indicate that the level of VRN1 expression controls earliness in exe mutants independently of VRN2.     

小麦TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析

TaPIM1是从小麦中克隆获得的1个病原诱导的小麦MYB基因,编码由323个氨基酸残基组成的蛋白TaPIM1。TaPIM1具有R2R3类MYB转录因子的典型结构,即2个保守的MYBDNA结合域(R2和R3)、核定位位点和酸性激活区。TaPIM1的全长氨基酸序列与已克隆MYB蛋白的一致性仅为43.69%以下,为植物MYB转录因子家族R2R3亚群的一个新成员。小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)侵染可快速诱导抗病小麦中TaPIM1基因的上调表达,说明TaPIM1可能参与小麦对纹枯病菌、根腐病菌的防御反应。将TaPIM1基因构建到由组成型强启动子CaMV35S控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38品系。通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,鉴定出转TaPIM1基因烟草T0代株系M66、M102、M110等12个株系。对转基因烟草T1代株系进行PCR、RT-PCR分析和青枯病菌抗性分析,结果表明,TaPIM1超量表达的转基因烟草株系M66、M102和M110对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抗性显著高于未转基因烟草对照,TaPIM1正向调控烟草对某些病原菌的防御反应。     

Cryopreservation of in vitro-grown meristems of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) by encapsulation-vitrification

Alginate-coated meristems from in vitro-grown strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) were successfully cryopreserved following dehydration by a vitrification solution. Excised meristems from cold-hardened plantlets at 4 °C for two weeks in the dark were encapsulated into alginate-gel beads containing a mixture of 2 M glycerol plus 0.4 M sucrose. These encapsulated and cryoprotected meristems were dehydrated with a highly concentrated vitrification solution (designated PVS2) for 2 hr at 0 °C prior to a plunge into liquid nitrogen. Successfully encapsulated vitrified meristems remained green and then developed shoots within one week after plating without intermediary callus formation. The average rate of shoot formation of encapsulated vitrified meristems amounted to nearly 90%. The cryogenic protocol was successfully applied to four cultivars of strawberry. It was also confirmed that encapsulated vitrified meristems cooled to - 196 °C produced higher shoot formation than encapsulated dried meristems. Besides, the recovery growth was much earlier than the latter. The encapsulation-vitrification method is easy to handle and produces high levels of shoot formation. Thus, the protocol promises for cryopreservation of strawberry germplasm. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

苗龄和农杆菌侵染时间对小麦茎尖转化效率的影响(英文)

本文将小麦幼苗划分为0日龄、1日龄、2日龄和3日龄苗,经茎尖部位的刺伤处理后,分别用带有uidA-nptll双元转化系统的农杆菌进行侵染,侵染时间设置30min、3 h和12 h三个处理,观察各处理组合下茎尖的GUS瞬时表达率.结果表明不同苗龄处理间无显著差异;而侵染时间处理间的差异达到显著水平;发现幼苗茎尖部位经刺伤后侵染处理30 min时,其茎尖uidA基因瞬时表达率可达31%,表明提高小麦茎尖直接转化的效率应具有较大潜力.     

干旱胁迫对春小麦不同品种(系)苗期生理生化指标的影响

[目的]为了比较不同小麦品种（系）的抗旱性,[方法]采用不同浓度PEG-8000溶液对7个春小麦品种（系）材料进行不同程度的水分胁迫处理,研究不同胁迫浓度（0,10%,20%,30%）和时间（第一天,第三天,第五天）对春小麦材料生理生化指标的影响。[结果]结果表明：随着干旱胁迫程度的增加和时间的延长,‘新春6号’的过氧化物酶活性较高和丙二醛含量积累速度较慢;‘4701’的脯氨酸含量积累速度较快;‘4501’在第Ⅴ天的30%浓度PEG-8000处理条件下可溶性糖含量最高。[结论]通过不同品种（系）在不同胁迫条件下4项生理生化指标的变化情况,筛选出‘新春6号’、‘4701’和‘4501’更适应干旱胁迫环境,为新疆春小麦苗期抗旱品种（系）的筛选提供理论基础。     

中国黄淮海地区小麦品种抗寒性及其与VRN1基因型的关系

冬季冻害是当前小麦生产面临的主要自然灾害之一。以我国黄淮海地区近年主栽的71个小麦品种为材料,通过对其抗寒性调查和VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1位点基因型的分子标记鉴定,研究小麦抗寒性的生物学基础,探讨VRN1基因在小麦抗寒性中的作用。结果表明,小麦的抗寒性与其他抗逆性状相关联,生产和国家区域试验证实具有较好抗旱节水、耐盐碱等抗逆特性的品种多具有较强抗寒性。VRN1是小麦抗寒性的关键性遗传调控位点之一,显性基因VRN1的存在会显著降低品种的抗寒性,具有2个或3个VRN1基因的品种一般抗寒性都很弱,而3个位点均为隐性基因是品种具有强抗寒性的必备条件。因此,建议我国黄淮海北部地区应加强选育、推广基因型为vrn-A1vrnB1vrn-D1的品种,以保证小麦安全生产。