共培养条件对农杆菌转化大豆子叶节的影响

为提高大豆的遗传转化效率,利用根癌农杆菌对大豆成熟种子的子叶节进行遗传转化,从影响农杆菌和大豆子叶节外植体双方的因素出发,重点研究共培养阶段培养基的pH值、光照条件和共培养时间三个因素对转化的影响,以寻找适宜农杆菌和外植体的平衡点。分析单因素试验和正交试验的研究结果表明,在共培养阶段,培养基pH值适宜范围为6.0~6.6,pH值以6.6为佳;提供10~16h·d-1光照均提高了转化效率,与完全黑暗差异显著;延长共培养时间显著提高转化效率,以7~10d为宜。本研究范围内以冀豆12、豫豆22和秦黄小粒12三个基因型大豆获得了较高转化效率,供试的6个大豆品种均获得了转基因植株,PCR和Southern分析表明植酸酶基因phyA基因已经整合到大豆基因组中。该结果对提高大豆的遗传转化效率有重要参考价值。     

基于Cre/loxP系统的无筛选标记转耐低磷转录因子GmPTF1大豆种质创制与分析

筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将Cre/loxPGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β-雌二醇诱导Cre/loxP系统删除筛选标记基因,获得了无筛选标记的转GmPTF1基因大豆。用PCR法扩增删除标记基因后的重组序列并测序显示,筛选标记基因在大豆基因组中已经被完全删除,重组序列中目的基因序列正确并保持了正确开放读码框;loxP位点重组出现一种新的拼接类型,重组后2个loxP序列全部缺失,新重组拼接位点长38 bp,与NCBI数据库的其他序列均无同源性,并且重组涉及2个loxP位点的外侧翼序列,造成Cre/loxP盒上游loxP和下游loxP外侧翼序列部分缺失。经过RT-PCR和Western杂交验证显示无筛选标记转基因大豆植株中GmPTF1能够正常转录和翻译,在根系、叶片及茎中的GmPTF1蛋白表达量均高于野生型对照,而在种子中与对照无显著差异。沙培试验表明,在低磷条件下无筛选标记转基因大豆苗期根系指标、生物干重、叶绿素含量和磷含量均显著高于野生型对照,而丙二醛含量低于对照。利用Cre/loxP重组系统可以有效删除转基因大豆中的筛选标记基因。     

转GmPTF1基因大豆在低磷胁迫下的表现

为研究大豆磷代谢转录因子基因GmPTF1对提高大豆磷利用效率的作用,用根癌农杆菌介导大豆子叶节转化法将GmPTF1导入大豆品种豫豆22.通过测定GmPTF1在转基因植株中的表达量以及苗期转基因植株和野生型对照植株在低磷胁迫下的形态和生理生化表现差异,来分析GmPTF1基因在导入大豆后发挥的生物学功能.结果表明:转基因植株的GmPTF1表达量显著高于野生型对照,其中以T1-32和T1-40为最高.在低磷胁迫下,GmPTF1基因表达增强型转基因大豆(T1-32和T1-40)的根系总长度、根总表面积、根体积、根干重、光合色素含量及植株磷含量都显著高于野生型对照植株,而丙二醛含量显著低于野生型对照植株;植株磷含量与GmPTF1表达量呈显著正相关(R=0.97**),以上结果均表明转基因植株的耐低磷能力优于野生型对照植株.本研究结果为利用转基因手段改善大豆乃至其他作物的耐低磷能力提供依据.     

转录组测序筛选野生大豆糖代谢途径干旱相关基因及其表达差异分析

野生大豆较栽培大豆有更广的遗传多样性，在组学水平整体分析其基因表达模式对筛选抗旱关键基因、 解析干旱胁迫响应调控网络和促进分子育种具有重要意义。本研究采用高通量测序技术对PEG6000模拟干旱胁 迫处理第0 h、6 h、12 h、24 h和48 h的30d苗龄野生大豆RNA进行转录组测序，获得了1796条糖代谢途径相关序 列。淀粉和蔗糖代谢途径通路注释的差异基因最多，半乳糖代谢途径次之；在获得的109个差异表达基因中，干旱 胁迫处理第12 h差异表达基因最多；对以上109个差异表达基因构建蛋白质相互作用网络，以节点度>10为标准筛 选中心节点，共获得8个关键基因。为进一步研究野生大豆干旱胁迫下的糖代谢相关基因奠定了基础。     

植酸酶根特异表达载体的构建及大豆转化

应用PCR方法分别从胡萝卜基因组中扩增出96bp的外展蛋白信号肽编码序列片段,从拟南芥基因组中扩增出1454bp的pyk10启动子片段,用RT-PCR方法从无花果曲霉（Aspergillus ficuum3.4322）中扩增出phyA基因,长1347bp。然后,分别克隆到pMD18-T载体。应用已设计的限制酶切位点,通...