成体干细胞的研究现状与展望

近年来，干细胞特有的生物学特性及其潜在的生物医学应用价值使之成为生命科学领域最热点、最前沿的课题之一。随着对干细胞研究的不断深入，人们发现成体干细胞除了具有较强的自我更新、高度增殖和多向分化潜能外还具有分化方向的可塑性。作者根据国内外研究成果，综述了成体干细胞的“可塑性”研究的最新进展，以及成体干细胞可塑性研究的前景及存在的主要问题。     

CaM在梨花芽分化过程中的含量变化

以梨为试材，对成花过程中的短枝芽和叶所含钙调素（ＣａＭ）的含量进行了测定。（１）短枝芽的ＣａＭ含量在整个成花前后都明显高于新梢芽的含量，特别是在成花的发端期突然成倍增加，形成高峰；（２）短果枝叶的ＣａＭ与新梢叶有着相近的变化趋势，但在成花前后，短果枝叶的ＣａＭ含量明显高于新梢叶；（３）ＣａＡｃ处理可以使短枝芽所含ＣａＭ的峰值提前出现，ＴＦＰ处理可明显降低ＣａＭ含量和延迟其峰值到来。还就ＣａＭ在成花过程中的作用及与Ｃａ２＋的关系等问题进行了讨论。     

结构基因座和微卫星标记应用于绵(山)羊群体遗传分化的比较研究

对湖羊、同羊及长江三角洲白山羊的随机样本分别进行14个结构基因座和7个微卫星标记的遗传检测,比较由两种遗传标记获得的群体基因平均杂合度(H)、多态信息含量(PIC)及群体有效等位基因数(Ne);分别根据两种类型的基因频率资料,计算3个群体间的标准遗传距离并加以比较。结果表明:由微卫星等位基因频率获得的群体基因平均杂合度、多态信息含量及有效等位基因数显著大于结构基因座获得的,但在三群体中变化趋势是一致的;由结构基因座资料计算的3个群体间标准遗传距离为0 0268～0 2487,微卫星标记资料计算的3个群体间标准遗传距离为:0 2321～1 2313,绵山羊间显著大于绵羊群体之间。提示:结构基因座和微卫星标记一致揭示3群体内的遗传变异;同羊>湖羊>长江三角洲白山羊;微卫星标记较结构基因座标记更能表达近缘种间进化趋异水平,可将FCB11、MAF33、AE101、FCB128及FCB304位点作为研究绵山羊近缘种间遗传分化的标志性位点。     

SRSF10对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响

旨在克隆山羊SRSF10基因序列,明确其生物学特性,并通过过表达和干扰手段阐明SRSF10对山羊肌内脂肪细胞分化的影响。本研究以简州大耳羊(Capra hircus)为试验对象,利用RT-PCR技术克隆山羊SRSF10基因序列,并进行生物信息学分析; 利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术研究其在成脂诱导分化不同阶段细胞中的表达水平; 转染pcDNA3.1-SRSF10过表达载体和SRSF10-siRNA至山羊肌内前体脂肪细胞并诱导分化,通过油红O和Bodipy染色法从形态学上明确其对脂滴积聚的影响; 通过qPCR方法检测脂肪细胞分化标志基因表达的变化。结果显示,获得山羊SRSF10基因序列为1 026 bp,其中CDS区552 bp,共编码183个氨基酸; SRSF10在诱导分化96 h的肌内脂肪细胞中表达量最高; 过表达和干扰山羊SRSF10分别促进和抑制了肌内脂肪细胞中的脂滴积聚; 过表达后基因SREBP1、PPARγ和C/EBPα的相对表达量极显著上调(P < 0.01),干扰后分化标志基因SREBP1、PPARγ和C/EBPα相对表达水平极显著降低(P < 0.01)。结果表明,山羊SRSF10是肌内脂肪细胞分化的正调控作用因子,并且这种调控作用可能主要通过调节SREBP1、PPARγ和C/EBPα的表达来实现。     

西门塔尔牛胰腺间充质干细胞原代培养及其多向分化潜能研究

旨在对西门塔尔牛胰腺间充质干细胞（pancreatic mesenchymal stem cells,PMSCs）进行原代培养并研究其体外分化潜能,为细胞疗法和组织工程学方面提供新的种子细胞。本研究从3月龄的西门塔尔牛胚胎中无菌分离胰腺组织,分别采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离PMSCs,进行原代培养;绘制第3代、第9代、第15代细胞生长曲线并测定群体倍增时间及克隆形成能力,采用免疫荧光检测干细胞表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD34和CD45）,RT-PCR检测干细胞细胞表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166、CD34和CD45）;染色体核型分析检测其基因稳定性,通过向成脂、成骨、成软骨和成肝样细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,两种方法都可成功分离出PMSCs,细胞贴壁后形态均为长梭形,漩涡状生长,生长趋势呈典型的S形;第9代细胞群体倍增时间显著低于第15代而高于第3代（P<0.01）;第9代PMSCs克隆形成率显著低于第3代而显著高于第15代（P<0.05）;免疫荧光结果表明,PMSCs特异性表达CD29、CD44、CD73和CD90,RT-PCR结果显示PMSCs特异性表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD106和CD166,未表达造血细胞表面标志物CD34和CD45,与国际细胞治疗学会组织干细胞委员会指定的MSCs表面标记物相对应;核型分析表明,PMSCs为正常二倍体（2n=60,XY）,染色体基因组未发生变异;特异性染色和RT-PCR结果表明,从西门塔尔牛体内获得的PMSCs可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和肝样细胞。本试验证实两种方法均可成功建立西门塔尔牛PMSCs体外分离培养体系,PMSCs具有活性好、增殖速度快的特点,与MSCs有相似的生物学特性和多项分化的潜能。可为组织工程学提供新的种子细胞。     

circRNA-Zfp609对C2C12成肌细胞增殖和分化的影响

【目的】试验旨在探究circRNA-Zfp609调节C2C12成肌细胞增殖和分化的潜在分子机制。【方法】利用RT-PCR和测序分析小鼠骨骼肌组织和C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、骨骼肌组织及增殖12、24、36、48 h和分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的相对表达量;实时荧光定量PCR检测分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中肌细胞生成素（MyoG）和肌球蛋白重链（MyHC）的相对表达量。用circRNA-Zfp609的干扰表达载体（siRNA）干扰细胞,通过CCK-8测定siRNA对C2C12成肌细胞增殖率的影响;用实时荧光定量PCR检测siRNA干扰对circRNA-Zfp609、MyoG和MyHC相对表达量的影响。通过TargetScan 7.0和miRDB软件预测circRNA-Zfp609上与肌肉分化相关的miRNA位点,将筛选的miRNAs的过表达载体转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609与miRNA的互作关系。根据miRNAs对circRNA-Zfp609的互作,构建circRNA-Zfp609的野生型和突变型载体并转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609对miRNA的靶向关系。【结果】PCR和测序结果表明,小鼠骨骼肌中可表达circRNA-Zfp609;circRNA-Zfp609在小鼠骨骼肌中表达水平最高,在其他组织中的表达量由高到低依次是肾脏、肺脏、心脏、肝脏、胃、脾脏和小肠。与12 h相比,在C2C12成肌细胞增殖的36和48 h circRNA-Zfp609的相对表达量显著增加（P<0.05）;与分化第0天相比,在C2C12成肌细胞分化的第1、3和5天circRNA-Zfp609的相对表达量均显著增加（P<0.05）,MyoG、MyHC的相对表达量均极显著增加（P<0.01）。与NC组相比,siRNA组C2C12成肌细胞的增殖率和circRNA-Zfp609相对表达量均极显著降低（P<0.01）,MyoG和MyHC的相对表达量显著降低（P<0.05）。circRNA-Zfp609上有miR-150-5p、miR-327、miR-344g-3p和miR-615-5p 4种与肌肉分化相关的miRNAs。circRNA-Zfp609与miR-615-5p的吸附能力最强,具有靶向结合作用。circRNA-Zfp609可以作为分子海绵与调控肌肉分化相关的miR-615-5p相互作用。【结论】circRNA-Zfp609在小鼠的组织中广泛表达,在骨骼肌中表达水平最高;circRNA-Zfp609在C2C12成肌细胞增殖和分化的不同时期差异表达,circRNA-Zfp609上有4个与肌肉分化相关的miRNAs,其中miR-615-5p与circRNA-Zfp609具有靶向关系。本研究结果可为与家畜骨骼肌生长发育相关的研究提供参考。     

藏绵羊KLF7基因表达特征分析及其过表达对前脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】分析藏绵羊Krüppel样因子7(Krüppel-like factor 7,KLF7)基因表达特征,研究过表达该基因对前脂肪细胞增殖及分化的影响。【方法】从藏绵羊脂肪组织中分离前脂肪细胞进行培养及成脂诱导,应用实时荧光定量PCR技术检测KLF7基因在藏绵羊7个组织(大脑、皮下脂肪、肾脏、背最长肌、瘤胃、睾丸和回肠)和前脂肪细胞不同分化阶段(第0、2、4和8天)的mRNA相对表达水平;应用RT-PCR方法从藏绵羊脂肪组织中扩增KLF7基因CDS区序列,并将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体获得pcDNA3.1-KLF7过表达质粒,转染前脂肪细胞;应用实时荧光定量PCR方法检测脂肪细胞增殖及分化标志基因mRNA表达水平;采用EdU和CCK-8方法分别检测过表达KLF7基因对EdU阳性细胞数和细胞活力的影响;采用油红O染色检测过表达KLF7基因后脂肪细胞脂滴生成量。【结果】KLF7基因在藏绵羊7个组织中均有表达,其中在大脑中的表达量最高,其次为皮下脂肪和肾脏,均显著高于其他组织(P<0.05);诱导分化第2、4和8天脂肪细胞mRNA表达量均显著高于分化前(P＜0.05),且分化第2天表达量最高;pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞2 d后显著或极显著抑制增殖标志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的表达水平(P＜0.05;P＜0.01),极显著降低细胞活力及EdU阳性细胞数量(P＜0.01);pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞,诱导分化8 d后,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相对表达水平显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01),且脂质沉积极显著减少(P＜0.01),表明过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞增殖及分化。【结论】KLF7基因在藏绵羊多个组织中广泛表达,且大脑、皮下脂肪、肾脏中表达量较高;诱导分化后脂肪细胞表达量显著高于分化前,且分化第2天表达量最高;过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞的增殖及分化。试验结果为阐明藏绵羊脂肪沉积的分子调控机制提供了基础数据。     

板栗花器分化发育期气候因子对其产量形成的影响

利用淳安县１９７３～１９９２年板栗产量和相应的气象资料，就板栗花器分化期一系列气象因子变他对其产量形成的作用显著性及其丰歉年景作用权重作分析研究。结果表明，４月和５月日照时数、越冬极端最低温度、５～６月降水量是影响气象产量的关键因子，此４因素对气象产量的作用权重占年总气象产量的７５．５５％～９４．４５％，在此基用上进一步提出了该县板栗产量模式及丰产建议。     

胎里红柿早期丰产栽培技术

胎里红柿早期丰产栽培技术要点为，施足基肥，大穴栽植；科学施用肥、水，冬、夏剪相结合，调控营养生长与生殖生长；使用生长调节剂及各种农业技术措施促花和提高坐果率，科学防治病虫害等。