柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3在293T细胞中的表达研究

为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3（Eimeda tenella calcium-dependent protein kinases3,EtCDPK3）基因的重组质粒pCAGGS-EtCDPK3,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其含完整开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM．Teasy载体,构建pGEM—Teasy-EtCDPK3重组质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3。该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtCDPK3基因的表达情况。结果显示所构建的真核重组表达质粒pCAGGS—EtCDPK3经过双酶切鉴定,可见1条大小约为1302by的目的条带,测序结果与实验室已获得的EtCDPK3序列完全一致;Western blot结果可见大小约为49kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光。这些研究结果表明已成功构建了EtCDPK3的真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtCDPK3的功能和制备DNA疫苗奠定了基础。     

钙与钙调素对番茄果实乙烯生物合成和信号转导基因表达的调控

为了研究CaM和Ca^2 在调控乙烯生物合成和信号转导组分基因表达中的相互关系,利用272mmol／L CaCl2及272mmol／L CaCl2 100μmol／L W5(或W7)处理绿熟期番茄果实圆片,然后采用无菌培养的方法在20℃的条件下进行培养。结果表明：CaCl2处理能够抑制番茄果实圆片的乙烯生成,抑制LeACO1,NR,LeERF2基因的表达,而CaCl2 W5(或W7)能消除Ca^2 对果实圆片乙烯生成及LeACO1,NR,LeERF2基因的表达的抑制作用,但CaCl2和CaCl2 W5(或W7)处理均对LeACS2基因表达影响不明显。以上研究结果表明外源钙处理对乙烯生物合成和信号转导途径中相关基因表达的影响可能与CaM有关。     

葡萄风信子黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

以葡萄风信子‘亚美尼亚’的根、茎、叶、花为材料,采用RT-PCR技术克隆得到一条FLS基因,命名为MaFLS2。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长为1 152 bp,含有完整的开放读码框1 056 bp,编码353个氨基酸,MaFLS2蛋白是一种亲水性蛋白,氨基酸序列含有典型的DIOX_N结构域(2-酮戊二酸-双加氧酶活性的N端区域)和2OG-FeII_Oxy超家族结构域,属于2-酮戊二酸-双加氧酶(2-ODDs)蛋白家族。实时定量PCR结果显示,MaFLS2基因在蓝白葡萄风信子中的表达存在组织特异性,蓝色品种‘亚美尼亚’中在花蕾未着色时表达量最高,而白色品种‘白丽人’在根中表达量最高, 在花发育的不同阶段,MaFLS2基因在‘亚美尼亚’中的表达峰值出现在花蕾未着色时期,基因表达总体呈现出先降低后升高再降低的趋势,而在‘白丽人’中的表达峰值出现在转色中期,总体呈现出先升后降的趋势。研究结果为开展单子叶植物花色育种提供了理论依据。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

菠萝AcPLD2基因多克隆抗体制备及其在果实黑心病发生中的表达分析

菠萝是中国最具有特色和竞争优势的热带水果之一,但采后菠萝果实不耐贮藏,极易发生黑心病,严重影响果实品质和商品率,而且威胁菠萝产业的健康发展.因此减少采后菠萝损失直接关系到热区农民的经济收入.黑心病是采后菠萝果实一种常见的生理性病害,由于该病的生理机制尚不清楚,所以国内外尚未有完全控制黑心病发生的方法.目前关于菠萝黑心病...     

微囊藻毒素对水稻幼苗营养吸收的影响

为进一步解析作物对水体中微囊藻毒素(MCs)的适应机制,通过水培试验研究MCs对水稻幼苗营养吸收及质膜H~+-ATPase基因表达的影响。结果表明:胁迫7 d后,1μg·L~(-1)MCs组水稻幼苗根系活力增加。10μg·L~(-1)MCs组水稻幼苗根系活力和质膜H~+-ATPase活性增加,促进了矿质营养(Mg~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)和NO_3~-)的吸收。其中质膜H~+-ATPase活性上升与OSA1、OSA2、OSA3、OSA4、OSA6、OSA8和OSA9表达上调有关。高浓度MCs(100μg·L~(-1)和1000μg·L~(-1))组水稻幼苗根系活力和质膜H~+-ATPase活性降低,阻碍了水稻幼苗对矿质营养的吸收,此时质膜H~+-ATPase的基因表达呈下调趋势,且降低程度随MCs处理浓度增大而增强。恢复7 d后,10μg·L~(-1)MCs组根系活力、质膜H~+-ATPase活性和营养元素含量恢复至对照水平。100μg·L~(-1)MCs组各指标均优于胁迫期,而1000μg·L~(-1)MCs对营养吸收的抑制未恢复。研究表明,MCs胁迫导致的水稻幼苗中营养元素含量的变化受质膜H~+-ATPase活性的调控,且调控能力受MCs浓度限制。     

外源喷施FeSO4对‘黄金梨’黄化叶片氮代谢相关酶活性及基因表达量的影响

为了探寻供铁水平对梨叶片氮代谢相关酶活性及基因表达量的影响,利用不同浓度FeSO₄喷施‘黄金梨’,分析处理3、6、9 和12 d后‘黄金梨’叶片中N含量,硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）的酶活性及其基因表达量差异。结果表明,通过不同浓度FeSO₄处理,‘黄金梨’叶片中N含量均显著性增加,达到正常叶片中含量水平。黄化‘黄金梨’叶片中4种酶活性显著低于正常叶片,供铁显著增强了黄化‘黄金梨’叶片中NR、NiR、GS和GOGAT酶活性。黄化‘黄金梨’叶片4种酶基因表达量显著低于正常叶片;随着喷施水平的提高,NR、Fd-GOGAT和GS基因表达量较黄化叶片有显著性上升;0.10%和0.15%的FeSO₄处理的NiR基因表达量显著高于未处理黄化叶片。该结果说明叶片施Fe增强相关酶活性,提高相关基因表达水平,有效的促进N含量的增加;叶面喷施外源FeSO₄可有效恢复黄金梨叶片黄化的症状,以0.10%~0.15%浓度处理效果最好。     

烤烟成熟期淀粉代谢关键酶活性与基因表达研究

【目的】探讨烤烟成熟期淀粉积累状况与淀粉代谢关键酶活性及其基因表达的关系,明确烤烟成熟期淀粉代谢的分子调控机制,为优质烟叶生产提供理论依据。【方法】以不同淀粉积累型烤烟品种秦烟96和豫烟6号为材料,测定成熟期烟叶淀粉含量及比例(直链淀粉、支链淀粉)和淀粉代谢关键酶活性,并对其关键酶基因(NtAGPase、NtGBSSⅠ、NtSSS、NtSBE、NtDBE、Ntα-amylase和Ntβ-amylase)进行实时荧光定量PCR分析。【结果】在烤烟发育成熟期,烟叶淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量呈先升高后降低的变化趋势,烟叶生理成熟期(移栽后85 d)其含量最高;随着烟叶的成熟,烟叶中支链淀粉所占比例逐渐增加。烤烟成熟期AGPase、GBSSⅠ、SSS、SBE和DBE活性呈先升高后降低的变化趋势,而烟叶淀粉酶活性则随着烟叶的成熟先降低后升高,烟叶过熟时其活性显著升高;与烟叶淀粉代谢关键酶活性变化趋势不同,其相关基因表达量变化差异较大。烟叶打顶至适熟阶段,AGPase和GBSSⅠ活性与烟叶直链淀粉含量相关性显著,对烟叶直链淀粉的积累贡献最大,NtGBSSⅠ对直链淀粉代谢起主要调控作用;SSS、SBE和DBE活性对烟叶支链淀粉积累起重要作用,NtSBE和NtDBE对烟叶支链淀粉代谢起主要调控作用。当烟叶由适熟至过熟时,淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶)主要参与烟叶的淀粉代谢活动。同一生态环境和栽培条件下,秦烟96淀粉积累较多,具有较高的支链淀粉比例。【结论】烤烟碳水化合物积累以淀粉为主,AGPase和GBSSⅠ是影响直链淀粉积累的关键酶,SSS、SBE和DBE对支链淀粉积累有重要作用,SBE和DBE活性的差异可能是造成烟叶直链淀粉与支链淀粉比值不同的重要原因。     

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株Nsp8基因分析及真核表达

应用生物信息工具和分子克隆技术对PEDV SHpd/2012株Nsp8基因编码的蛋白进行了结构和功能分析以及体外表达。结果显示,NSP8蛋白是一个含有194个氨基酸的亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜区。SHpd/2012毒株高度保守的NSP8氨基酸序列与CV777、AJ1102等毒株同源性高。NSP8蛋白也是一个单体蛋白,共有5个优势抗原表位。此外,本研究成功地在293T细胞内表达了NSP8蛋白,为进一步研究猪流行性腹泻病毒NSP8蛋白的功能提供了理论基础。