葡萄风信子FLS1基因克隆及其表达与花色性状之间的关联性分析

黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)是类黄酮合成分支路口重要的节点酶。FLS基因的表达不仅影响着黄酮醇合成,也影响着花青素苷积累和花色呈现。本研究采用PCR技术从葡萄风信子‘白丽人’中克隆到一条FLS基因(MaFLS1)。序列分析表明,MaFLS1cDNA全长1 152bp,编码383个氨基酸。同源比对及进化分析表明,MaFLS1属于2-酮戊二酸与Fe+2依赖型双加氧酶蛋白,具有典型的FLS蛋白功能域、DHQ底物特异结合位点、Fe2+和2-酮戊二酸绑定位点;MaFLS1与海枣、油棕的FLS同源性最高,可达74%~75%,与拟南芥、矮牵牛等模式植物亲缘关系较远。荧光定量PCR分析发现,MaFLS1基因在葡萄风信子中为非组织特异性表达模式,其根中表达量最高,鳞茎及花中的表达量其次,叶片中表达量最低;MaFLS1在3个不同花色的葡萄风信子品种5个不同花发育时期表达差异显著,在白色品种‘白丽人’花发育的早期(S1和S2)时期表达较高,粉色品种‘粉日出’和蓝色品种‘亚美尼亚’晚期(S3和S4)表达量最高。本研究为进一步探讨葡萄风信子FLS基因在花色呈现中的功能及黄酮醇支路的分流竞争对花色的影响提供基因资源和依据。     

6种葡萄风信子倍性鉴定

葡萄风信子是一种著名春季观赏球根花卉,具有重要的经济价值和生态价值。但由于其常见品种的倍性存在争议,严重限制了该植物科研和遗传育种工作的进展。以6种典型的葡萄风信子品种为材料,通过染色体常规压片法鉴定葡萄风信子蔚蓝为二倍体(2n=18),后以葡萄风信子蔚蓝作外标,进一步利用流式细胞仪鉴定其他5种品种葡萄风信子的倍性。结果表明,‘黑眼睛’、‘日出’为二倍体,‘白色丽人’、‘海洋的魔法’为三倍体,亚美尼亚为四倍体。其中葡萄风信子蔚蓝、‘黑眼睛’、‘日出’、‘白色丽人’和‘海洋的魔法’均为首次报道,希望为后期葡萄风信子的品种选育工作提供参考。     

葡萄风信子MaMYB1基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄风信子MYB转录因子基因(MaMYB1),并对其进行生物信息学和表达模式的分析。【方法】以开蓝色花的葡萄风信子品种"亚美尼亚"为材料,利用RACE技术得到其MaMYB1基因cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用酵母单杂交方法检测其转录激活活性,并用实时定量PCR方法分析该基因在根、茎、叶及不同发育时期花中的表达特性。【结果】通过RACE-PCR,克隆得到953bp的MaMYB1基因,其开放阅读框长750bp,编码249个氨基酸,推测的蛋白分子质量约为27.7ku,理论等电点为9.3。MaMYB1基因编码的蛋白序列中具有2个典型的MYB结构域R2和R3,且在R3结构域下游含有与BHLH蛋白结合的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域。MaMYB1与玉米ZmP1及拟南芥MYB12的关系较近。酵母单杂交检测表明:MaMYB1具有转录激活活性。实时定量PCR分析结果表明:MaMYB1在不同组织中均有表达,以在花中表达量较高,且在花不同发育时期表达量差异显著。【结论】从葡萄风信子中克隆到1个新的MYB基因MaMYB1;推测该基因可能参与了葡萄风信子花发育过程的调控。     

天香百合、药百合黄酮醇合成酶FLS基因克隆和表达分析

以天香百合(Lilium auratum)和药百合(L.speciosum var.gloriosoides)为研究材料,分别克隆获得黄酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)基因,命名为LaFLS和LsFLS。实验结果表明,LaFLS和LsFLS基因均含完整的开放阅读框1 035 bp,均编码344个氨基酸,氨基酸序列高度保守,均具有DIOX-N结构域和2-酮戊二酸和铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶结构域,属于2-酮戊二酸和铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶超家族;系统进化分析表明,LaFLS和LsFLS除与东方系百合西伯利亚和索邦的FLS亲缘关系最近外,与百合科郁金香(Tulipa fosteriana)等亲缘关系较近;生物信息学分析显示,LaFLS和LsFLS蛋白无信号肽序列和跨膜结构域,均为亲水性蛋白,亚细胞定位结果显示二者主要定位在细胞质中。基因表达分析结果表明,在花蕾发育过程中,LaFLS和LsFLS随花蕾发育出现先上升后下降再上升的趋势,而且在花被片无色区的表达量显著高于有色区域。     

滇牡丹中3个类查尔酮合成酶基因的克隆与表达

从开黄花的滇牡丹转录组中分离了3个CHS基因,利用生物信息学预测其基因功能,并比较不同花发育时期CHS基因的表达量。结果显示:3个CHS基因的cDNA全长分别为1 173、1 185、1 128 bp,依次命名为PdCHS1(GenBank登录号MK516264)、PdCHS2(GenBank登录号MK516265)和PdCHS3(GenBank登录号MK516266),分别编码390、394和375个氨基酸;这3个CHS基因编码的蛋白均为无信号肽的非分泌蛋白,均含查尔酮合成酶活性位点基序(G/A) FGPG。聚类结果显示,滇牡丹中的3个CHS蛋白归属于不同分支。基因表达结果显示,PdCHS1基因在花蕾期和花蕊中表达量较高,PdCHS2基因在末花期和初花期表达量较高,PdCHS3基因在末花期和花蕾期表达量较高。这3个CHS基因分别参与不同次生代谢产物的合成,推测PdCHS1参与柚皮素查尔酮,PdCHS2参与芪类化合物,PdCHS3参与聚酮类化合物的生物合成。     

葡萄风信子转录因子MaMYB2的克隆及表达模式分析

试验从葡萄风信子"亚美尼亚"中利用RACE技术克隆了一个MYB类转录因子,命名为MaMYB2,Genebank登陆号为KJ744038。克隆到的MaMYB2全长711bp,开放阅读框为600bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白分子量约为22.34ku,理论等电点为5.46,保守域具有DNA结合位点;与矮牵牛(AAF66730.1)关系最近;核定位试验表明MaMYB2蛋白定位在细胞核中;实时定量PCR分析了MaMYB2在葡萄风信子"亚美尼亚"不同组织部位中的表达模式,结果不同组织中均有表达,在花中表达量最高,且随着花色变深表达量逐渐升高。结果表明,MaMYB2有可能参与了葡萄风信子中花青素积累的转录调控。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

核桃TT1类转录因子的筛选及干旱响应分析

TT1基因（transparent testa1）在植物逆境响应中有重要作用。核桃是重要的经济树种，其产量和质量均受环境影响。为进一步探索核桃（Juglans regia）抗逆机制，以‘香玲’核桃为试验材料，克隆获得核桃JrTT1基因，并进行基因表达和生物信息学分析，预测该基因的基本生物功能。结果表明，JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因的开放阅读框（OFR）分别为1 014、1 023、1 029 bp，蛋白分子量分别为37 763.51、38 492.94、38 136.36 u，含有氨基酸数分别为337、340、342，理论等电点分别为7.88、7.19、8.89。与其他物种的同源TT1蛋白具有较近的进化关系。且其上游1 200 bp启动子中含有多种与干旱逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）发现，JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因在PEG₆₀₀₀胁迫下能不同程度地被诱导表达，且在叶和根中的表达趋势不同。表明JrTT1基因可以响应干旱胁迫诱导，并具有组织表达特异性，推测其在核桃逆境响应中具有一定作用。     

牡丹PoCCS1基因的克隆与表达分析

铜/锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for superoxide dismutase,CCS)负责将铜离子转运至Cu/Zn-SOD，从而激活SOD酶活性，参与植物活性氧清除，在植物抗逆中发挥重要作用。研究旨在克隆牡丹PoCCS1基因，并对基因序列特征、组织表达模式、盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式、不同牡丹品种氧化胁迫下的表达模式进行分析，为深入研究PoCCS1在牡丹非生物胁迫响应中的功能奠定基础。利用RT-PCR技术克隆‘凤丹’PoCCS1基因(GenBank登录号:MZ574405)，利用生物信息学方法分析PoCCS1序列特征，利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析PoCCS1的表达模式。结果表明，PoCCS1基因编码区全长为996 bp，编码蛋白含331个氨基酸，相对分子量为34.98 ku，包含植物CCS蛋白的3个典型结构域，进化分析表明PoCCS1与多种植物的CCS同源性较高，且与葡萄VvCCS亲缘关系最近；PoCCS1在‘凤丹’的根、茎和叶中表达水平相近，‘凤丹’盐胁迫8 h后，PoCCS1在叶片和根中的表达受到显著诱导，干旱胁迫8 h后，PoCCS1在叶片中的表达下调，根中表达无显著变化；4个抗氧化能力不同的牡丹品种‘鲁荷红’‘凤丹’‘香玉’和‘乌云集盛’氧化胁迫处理后PoCCS1表达模式差异显著，随处理时间增加，在抗氧化能力强的‘乌云集盛’和‘香玉’中PoCCS1的表达显著上调并在处理4 h后保持较高水平，在抗氧化能力较弱的‘凤丹’中表达稳定，在抗氧化能力最弱的‘鲁荷红’中先升后降并在处理4 h后显著下调。综上，PoCCS1基因编码蛋白具有植物CCS的完整典型结构，可能参与牡丹响应盐胁迫和干旱胁迫，并可能与不同牡丹品种抗氧化能力差异相关。     

肉鸡MTHFR基因的克隆和表达水平研究

采用RT-PCR方法克隆了鸡MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用定量PCR(qPCR)技术检测组织表达特性。结果表明,鸡MTHFR基因的cDNA序列长度为2 342 bp(GenBank登录号: KU351685),开放阅读框长1 956 bp,编码651个氨基酸;进化树分析表明,鸡MTHFR氨基酸序列与绿头鸭和鸿雁的关系较近。MTHFR氨基酸序列包含保守的MTHFR superfamily结构域,为亲水蛋白;二级结构主要是α-螺旋(38.71%)和无规则卷曲(36.41%);亚细胞定位显示,该蛋白存在于细胞质和细胞核的概率分别为60.9%和30.4%。qPCR分析表明,MTHFR基因在所检测鸡的8种组织中均有表达,其中在心脏中表达水平最高,在腿肌中的表达水平最低;叶酸缺乏试验表明,母鸡叶酸缺乏能极显著增加子代肉鸡MTHFR基因在肝脏中的表达水平(P<0.01)。研究结果可为进一步研究MTHFR基因的结构和功能以及叶酸在家禽生产中的应用提供资料。     

落叶松-杨栅锈菌MlpNHA1-like基因的克隆及序列分析

落叶松-杨栅锈菌引起的杨树叶锈病是杨树的一种重要病害。通过系统发育分析和序列相似性比对确定落叶松-杨栅锈菌标准菌株基因ID 45128为酿酒酵母NHA1直系同源基因以及基因ID 116278为NHA1相关基因,分别命名为MlpNHA1和MlpNHA1-like。以夏孢子cDNA为模板,运用RT-PCR技术,同源克隆获得中国菌株MlpNHA1-like基因的ORF片段,即MlpNHA1-like (wh03),长度为1 545 bp,编码514个氨基酸。结果表明,生物信息学预测分析显示MlpNHA1-like (wh03)蛋白具有与酿酒酵母NHA1蛋白相同的保守结构域c_cpa1,且同样具有系列疏水跨膜结构,亚细胞定位预测结果表明目的蛋白分布在质膜区域。通过克隆落叶松-杨栅锈菌中国菌株MlpNHA1-like基因并开展序列分析,为解析该锈菌MlpHOG1蛋白介导通路在病原菌侵染致病及响应外界胁迫中的作用提供帮助。     

薄荷Eβf合成酶基因(Tspa11)的克隆、序列分析与表达特性

采用室温贮藏的方法，研究贮藏时间对大红袍花椒和青花椒品质性状的影响。结果表明，贮藏1、2、3 a时，大红袍花椒果皮麻味素含量和脂肪酸含量降低，分别较对照（当年）降低14.4%、50.8%、69.7.0%和2.0%、10.0%、14.0%，青花椒分别降低11.0%、40.5%、44.2%和6.5%、21.7%、22.8%。种子贮藏1、2、3 a时，大红袍花椒和青花椒脂肪酸含量分别较对照（当年）降低了0.98%、19.6%、20.2%和2.2%、15.3%、22.4%。同时，脂肪酸组分含量受贮藏时间的影响显著。贮藏1 a时，大红袍花椒和青花椒果皮亚麻酸含量分别较对照提高19.2%和26.9%（P＜0.1），贮藏3 a时，分别减少27.6%和35.8%（P＜0.1），亚油酸含量分别减少22.2%和15.7%。贮藏1 a的花椒果皮氨基酸含量显著提高，但随时间延长，其含量降低。同时，贮藏1 a时，大红袍花椒果皮中天冬氨酸、脯氨酸、胱氨酸和精氨酸含量分别较对照提高45.2%、55.4%、66.7%、128.6%（P＜0.1），青花椒果皮中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量分别较对照提高40.8%、30.7%和60.9%（P＜0.1）。室温条件下，花椒保存时间以1 a以内为宜。     

林麝生长激素基因的克隆与生物信息学分析

了解林麝生长激素（GH）基因序列结构特点,为进一步研究GH基因的结构功能遗传变异规律及其与生长性能的关系提供科学依据。根据GenBank上已公布的绵羊全基因组GH基因序列设计合成4对特异性引物,以林麝基因组DNA为模板进行PCR扩增,将所获得的序列拼接,获得林麝GH基因CDS区序列,采用ExPASy等分子生物学工具对林麝GH蛋白的理化性质、二级结构、蛋白功能等进行预测。结果表明,林麝GH基因CDS区全长657 bp（GenBank登录序列号为KU296865）,编码218个氨基酸。α-螺旋结构和卷曲结构构成了林麝GH蛋白二级结构的骨架,为跨膜蛋白,同时第1~26位氨基酸为信号肽,第27~218位氨基酸残基为生长激素结构域。进化分析结果表明,林麝与羊的关系最为接近,在分子水平上符合物种进化理论。本研究成功克隆了林麝GH基因CDS区序列,其序列保守性强,为下一步林麝GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

花楸树热激蛋白SpHSP70-2基因的克隆及表达分析

探究花楸树响应高温胁迫的分子机制,为遗传改良和耐热品种的选育提供基础,依托花楸树叶片转录组测序数据,采用反转录PCR（RT-PCR）方法克隆得到HSP70家族中的1个基因,命名为SpHSP70-2,同时对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对其组织特异性和应答高温胁迫的表达模式进行了分析。结果表明,经克隆得到的SpHSP70-2基因与花楸树叶片转录组测序数据的基因序列一致,SpHSP70-2开放阅读框（ORF）长度为1 704 bp,编码567个氨基酸。SpHSP70-2蛋白具有HSP70特征结构域:核苷酸结合结构域（NBD）和底物结合结构域（SBD）;SpHSP70-2基因无内含子;SpHSP70-2二级结构中具有ɑ螺旋（32.63%）、延伸链（23.28%）、β转角（7.23%）和随机卷曲链（36.86%）;SpHSP70-2蛋白为疏水性蛋白,有11个跨膜螺旋,无信号肽;SpHSP70-2与同科的苹果、白梨的HSP70同源性最高,为90%以上;SpHSP70-2在花楸树的果实中表达量最大,在茎、根中表达量次之,在花中的表达量最小;在42℃高温胁迫处理下,SpHSP70-2表达量呈现先升高后下降趋势,在2 h时达到极值,随后表达量略缓慢下降,说明SpHSP70-2基因参与调控花楸树对高温胁迫的响应。研究结果为今后花楸树响应热胁迫的分子机制研究和引种驯化方面提供基础。     

沙柳SpsNAC042基因克隆及逆境表达分析

采用同源克隆的方法获得沙柳SpsNAC042基因，通过生物信息学分析、组织特异性表达分析、逆境表达分析。结果表明，SpsNAC042基因的开放阅读框序列长度为900 bp，共编码299个氨基酸，测定为亲水性不稳定蛋白。组织特异性表达分析得出花中的基因相对表达量最高，幼叶、茎9~15节间、根、成熟叶的表达量依次降低，茎尖的表达量最低。SpsNAC042基因在干旱处理下与对照组相比整体呈增长趋势，并在8 h处达到最高；在低温处理下，基因表达量迅速积累，在2 h处达到最高，然后维持在较低水平表达；在盐和高温处理下SpsNAC042基因缓慢积累，后期迅速增高，最终在24 h处达到最高。研究表明SpsNAC042基因参与逆境应答反应，为深入开展沙柳NAC基因对生物和非生物胁迫应答研究提供了参考价值。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

青花菜BoBURP1基因的克隆与表达分析

BURP是一类存在于植物中的特有蛋白,在生长发育和逆境响应等方面起重要作用。试验从青花菜中克隆到一个BURP基因,命名为BoBURP1,在生物信息学分析的基础上,用RT-PCR研究了它在不同器官中的表达模式。研究结果表明,BoBURP1的基因组DNA全长2 030 bp,具2个内含子;编码区全长为1 872 bp,编码623个氨基酸;推导的蛋白质分子量为70.795 6 ku,等电点为8.65。系统发育分析结果表明,BoBURP1与12种不同植物的同源蛋白可分为3组,BoBURP1与十字花科植物同源序列的相似性最高,在进化树上聚为一组。RT-PCR结果表明,BoBURP1在根、茎、叶、花蕾、花和角果中均有表达,叶、花蕾和花的表达量最高,而根和茎中的表达量最低。     

干旱胁迫对平邑甜茶不同生长时期氮素吸收利用的影响

为研究干旱胁迫对苹果砧木平邑甜茶不同生长时期N素吸收利用效率的影响,以1年生盆栽平邑甜茶为材料,设置干旱胁迫和对照2组处理,其中干旱胁迫是在施肥前对平邑甜茶提前2周控水,保持盆土45%～55%田间最大持水量;对照正常供水,保持盆土75%～85%田间最大持水量。以¹⁵N标记的尿素为N源,分别于4月10日、5月10日、7月10日和9月10日4个生长时期施1.0 g ¹⁵N标记的尿素,分析干旱胁迫对平邑甜茶4个生长时期的植株N含量、各器官肥料N的百分率(N_dff)、¹⁵N分配率、利用率以及N素转运代谢相关基因表达量的影响。结果表明：1)与对照相比,4个生长时期中,干旱胁迫均降低平邑甜茶植株N含量、各器官对N的吸收转运能力以及N素利用率,其中在7月生长期降低的最显著,植株N含量降低27.0%、根、茎、叶的N_dff值分别降低23%、35%、40%、N素利用率降低42%。2)干旱胁迫下平邑甜茶各器官氮素分配由地上部分向地下部分转移,优先供应植株生长中心。3)干旱胁迫下平邑甜茶根系对N素吸收...     

不同品种辣木钙的动态变化特征研究

为了解不同品种辣木钙的动态变化规律,对西双版纳不同树龄的多油辣木、狭瓣辣木和‘PKM1’辣木叶、叶柄、枝中钙含量的年动态变化特征进行比较研究。结果表明,辣木钙含量随品种、树龄、时间而变化。辣木钙含量呈现叶>叶柄>枝、3 a树龄>14 a树龄,随时间变化逐渐降低。叶中钙含量呈现多油辣木和PKM1辣木>狭瓣辣木;叶柄中钙含量呈现PKM1辣木和狭瓣辣木高于多油辣木;枝中辣木钙含量受品种、受树龄的影响而呈现不同差异。辣木钙累积量呈现枝>叶>叶柄,狭瓣辣木最高、多油辣木和PKM1辣木最低。辣木叶钙含量与蛋白质含量成极显著的正相关。     

撒坝猪MCUR1基因克隆、生物信息学分析及其组织表达量检测

本研究克隆了撒坝猪MCUR1基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测其在撒坝猪、大白猪不同组织中的表达水平。根据GenBank上公布的猪的MCUR1基因序列(登录号:XM_003128183.4)设计引物,通过PCR扩增及测序获得撒坝猪MCUR1基因CDS序列,该序列全长1 095 bp,编码364个氨基酸;MCUR1蛋白的分子式C₁₇₈₇H₂₉₄₉N₅₃₃O₅₀₃S₁₄,相对分子质量40.398 ku,理论等电点(pI)10.27,不稳定系数55.70,脂肪指数95.99,平均亲水性为-0.213,属于亲水蛋白;MCUR1蛋白没有信号肽和跨膜结构,含有2个螺旋卷曲结构,主要在细胞质中发挥生物学功能;含有32个磷酸化位点;含有一个CpG island;二级结构由58.24%的α-螺旋,4.12%的β-转角,30.22%的无规则卷曲,7.42%的延伸链构成;猪MCUR1基因编码区序列与牛、鸡、狗、山羊、人、猴、鼠、绵羊的同源性分别为85.3%、68.0%、83.6%、87.9%、84.4%、80.3%、76.8%、88.2%,与绵羊、山羊、牛的亲缘关系较近,与鸡的关系较远;在肝脏中的表达量最多,肺脏中的表达量最少。在大白猪的背最长肌中MCUR1的表达量高于撒坝猪的背最长肌(P<0.01)。