基于非洲猪瘟病毒标准物质的荧光PCR检测试剂盒初步评价

为探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)标准物质作为试剂盒评价体系的可行性,比较了市场上5种主流品牌ASFV荧光PCR检测试剂盒的检测性能。使用ASFV P72基因核酸标准物质作为模板,根据5种试剂盒说明书分别进行相应的荧光定量PCR检测,结合扩增曲线、Ct值,分析不同试剂盒的敏感性、可重复性以及所需反应时间。结果显示:5种试剂盒的阴性、阳性对照均成立,最低检测限均为5.9×10^-1拷贝/μL;4个厂家的试剂盒线性关系R2>0.98,其中最优的R²=0.994,离散度最小;各试剂盒的实际反应耗时与理论反应耗时均有一定差异(0.20~0.96 h)。结果表明,各生产厂家使用P72基因作为靶基因研制的ASFV荧光PCR检测试剂盒都可以使用ASFV标准物质作为评价体系,来评判试剂盒的检测性能。本试验为各实验室不同样品检测的ASFV荧光PCR检测试剂盒选择提供了一种可用的评价方法。     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

山东省菏泽市某规模猪场不同猪群伪狂犬病野毒感染情况调查

为了解规模猪场不同猪群的伪狂犬病病毒(PRV)感染情况及场区病毒载量分布特点,在山东省菏泽市某规模猪场,利用实时荧光定量PCR方法,对该猪场不同孕龄母猪、不同阶段生长猪群,以及各生产阶段场区环境,采集猪鼻拭子和场区环境拭子进行PRV-gE核酸检测,并对检测结果进行统计分析。结果显示:在294份猪鼻拭子中,检出42份PRV-gE核酸阳性,总阳性率为14.28%;母猪群PRV-gE阳性率为17.83%(23/129),且妊娠前后各阶段阳性率呈先上升后下降趋势,中期较高(24.00%),但差异不明显(P>0.05);不同阶段生长猪群的平均PRV-gE阳性率为11.52%(19/165),随日龄增加,阳性率也呈先上升后下降趋势,80~90日龄育肥猪最高(28.13%),与其他生长阶段猪群差异明显(P<0.05);除饲料、水源、上猪台和出猪台外,其他大部分场区环境均检测到PRV-gE核酸阳性;育肥猪群病毒载量最高,为3.6×105拷贝数/mL,其猪舍环境的病毒载量也较高,与其他环境及生长阶段猪群差异均明显(P<0.05)。结果表明,不同猪群包括免疫猪群均可遭受PRV野毒感染,尤其是母猪妊娠中期和猪育肥阶段早期,且大部分场区环境均可被污染。结果提示,规模猪场要加强各种猪群尤其是育肥猪群的伪狂犬病免疫,通过监测来调整和优化免疫程序,同时要加强生物安全,防止病毒传入和扩散。     

鉴别H5亚型两种分支禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化,同时开展了特异性和敏感性试验,以及临床应用检测。结果显示:该方法具有良好的特异性,与其他亚型禽流感病毒及常见禽病病毒无交叉反应;对H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支毒株的检测灵敏度分别为495.0 copies/μL和22.3 copies/μL;100份临床家禽拭子禽流感病毒检测结果与常规RT-PCR和病毒分离检测结果一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异、敏感、准确、耗时少,同时还可区分不同分支,可应用于H5亚型禽流感病毒的准确、快速检测。     

口蹄疫病毒A型竞争ELISA抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用

为评价口蹄疫病毒A型竞争ELISA(cELISA)抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用前景,对2017年从福建省三明市采集的336份黄牛、奶牛、羊和猪血清样品,用A型cELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。结果显示,92份黄牛血清、92份羊血清、92份猪血清、60份奶牛血清的A型抗体阳性率分别为13.04%、11.96%、20.65%、86.67%。从上述4种血清中,各挑选10份血清(阴性、阳性各5份)共40份,采用口蹄疫病毒液相阻断ELISA(LPB-ELISA)抗体检测试剂盒进行验证。结果显示:cELISA检测为阳性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阳性19份;cELISA检测为阴性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阴性17份;两种方法的κ值为0.8,总符合率为90.00%。结果表明,A型cELISA试剂盒与LPB-ELISA试剂盒的符合率和一致性均较高,可用于口蹄疫流行病学调查和血清学监测。     

云南省野猪源猪瘟病毒E2及5'NTR基因序列测定分析

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）感染猪引起的一种急性、热性、接触性传染病,严重危害我国养猪业健康稳定发展。本研究采用RT-PCR方法,对从云南省宁洱县2头病死野猪体内分离到的2株CSFV毒株进行了E2及5''NTR基因扩增、克隆及序列测定;采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件,对测得的序列与国内外参考毒株进行了同源性分析及系统发育分析。结果显示：2株野猪源CSFV株E2、5''NTR基因同源性分别为87.2%、100%,与国内外参考毒株同源性分别为81.0%~97.6%、93.6%~98.5%,与我国强毒株Shimen株的同源性分别为81.0%~81.2%、95.6%;2株野猪源CSFV毒株E2基因属于基因2.1亚型,5''NTR基因属于基因2.3亚型。氨基酸序列分析显示：其中一株分离毒株的E2基因有6个氨基酸具有2.1d分子变异特征,另一株兼有2.1d和2.1b亚型分支特征,可能是2.1b和2.1d亚型的过渡毒株。结果表明,云南省野猪源CSFV虽存在一定的遗传衍化,但总体比较稳定。本研究为云南省CSF防控提供了分子流行病学依据,为进一步做好分子变异等研究奠定了基础。     

湖南省部分地区病猪和屠宰猪群猪圆环病毒感染状况调查

为了解湖南省猪圆环病毒（PCV）流行情况,采用荧光PCR方法,对来自湖南省14个市州的821份临床病料和屠宰场猪淋巴结样品进行PCV1、PCV2、PCV3和PCV4荧光PCR检测。结果显示：在821份样品中,PCV阳性检出率为88.06%（723/821）,阳性检出率由高到低依次为PCV2（81.49%）、PCV3（33.98%）、PCV1（8.04%）和PCV4（1.10%）;278个样品存在两种及以上的PCV混合感染,以PCV2+PCV3混合感染最多,占82.01%;在地域分布上,PCV1、PCV2、PCV3在湖南省各地区均有分布,而PCV4分布范围较小,感染率低。结果表明,湖南省内PCV流行较为普遍,4种基因型病毒都存在,但以PCV2流行最为广泛,需要加强防控。